Radioactieve In situ Hybridisatie voor het detecteren van Divers genexpressiepatronen in Tissue

Het algemene doel van het volgende experiment is om regio's van specifieke genexpressie te identificeren en de timing en niveaus van genexpressie te karakteriseren om bij te dragen aan het begrip van genfuncties. Dit wordt bereikt door het weefsel dat in de procedure wordt gebruikt snel te oogsten en voor te bereiden om de integriteit van het weefsel te behouden. Als tweede stap wordt het weefsel behandeld om de achtergrondbinding van riboprobes te verminderen.

Vervolgens worden de ribo-probes gehybridiseerd met het weefsel en wordt de binding van de RIBA-probe gevisualiseerd. Door gebruik te maken van röntgenfilm of een lichtgevoelige emulsie worden resultaten verkregen die de locatie en het niveau van genexpressie tonen op basis van röntgenbeelden of donkerveld- en helderveldmicroscopie en -analyse. Bij het gebruik van Image J-software zijn er enkele kritieke stappen die correct moeten worden uitgevoerd, waarbij vaak fouten worden gemaakt; één daarvan is het voorkomen van achtergrondruis.

Er zijn verschillende stappen die kunnen leiden tot achtergrondruis, zoals een gebrekkige saturatie of hybridisatie bij een onjuiste temperatuur. Een andere oorzaak is RNA-contaminatie, waardoor uw RNA-sonde degradeert. U moet daarom zorgvuldig te werk gaan om alles RNA-vrij te houden.

En ten derde moet u ervoor zorgen dat er bij het dompelen van de coupes in de emulsie geen lichtlekken zijn in uw donkere kamer of blootstelling van de emulsie gedurende alle fasen van dat proces, dat drie weken kan duren. Hun Chen, een postdoc in mijn laboratorium, zal deze techniek demonstreren. Nadat een vers brein is geoogst en is afgespoeld met 1x PBS, wordt het brein ingebed in OCT-weefselmedium door het brein bij kamertemperatuur onder te dompelen in een mal die het medium bevat.

Zorg ervoor dat de hersenen zo zijn georiënteerd als nodig is voor het doorsnijden. Besproei vervolgens het droogijs met ethanol en vries het weefsel in door het blok in het mengsel van ethanol en droogijs te plaatsen. Snijd het ingevroren weefsel met een cryostaat in secties van 10 tot 12 micron dik, waarbij u er alert op let dat er geen ethanol in het blok terechtkomt, en monteer deze op super plus slides voor hersen- en embryonaal weefsel.

De optimale snijtemperatuur ligt tussen de -18 °C en -20 °C. Bewaar de coupes in een objectglasdoos bij -80 °C. Verplaats de objectglazen van de opslag bij -80 °C naar een metalen rek op droogijs.

Plaats vervolgens, terwijl u in een gecertificeerde zuurkast werkt, het rek in een oplossing van 4% paraformaldehyde die vooraf is verwarmd tot drie tot vijf graden Celsius boven kamertemperatuur. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie het rek uit de paraformaldehyde en was de coupes door het rek 15 keer in PBS te dippen. Herhaal deze wasstap tweemaal, waarbij elke keer een verse PBS-oplossing wordt gebruikt.

Dompel de slides vervolgens gedurende 10 minuten in vers bereide acetyleringsbuffer om aspecifieke binding van de RIBA-probe te verminderen. Was de slides daarna zoals voorheen, maar gebruik ditmaal tweevoudig SSPE als wassolution. Dehydrateer het weefsel via een serie van 70, 95 en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke oplossing.

Droog de objectglazen vervolgens gedurende ten minste 10 tot 15 minuten in de zuurkast. Na het synthetiseren van de RIBA-sonde, volgens de instructies in het geschreven protocol, berekent u het benodigde volume RIBA-sonde en hybridisatieluiding voor alle objectglazen. Warm het hybridisatiemengsel voor de Ribo-sonde vijf minuten voor op 65 °C.

Om de Ribo-probe te denatureren, pipetteert u 100 µL van de Ribo-probe hybridisatieloplossing en verdeelt u deze over het dekglas. Gebruik vervolgens een tweede glazen dekglas om de oplossing gelijkmatig over het weefsel en het dekglas te verspreiden. Plaats de slide horizontaal en met de bovenkant naar boven in een metalen rek; zodra alle slides gereed zijn, dompelt u het rek langzaam onder in een oliebad van 65 °C voor minimaal vier uur en maximaal 16 uur.

De olie vormt een luchtdichte afsluiting rond de dekglasjes na de incubatie; verwijder alle overtollige olie van het metalen rek waarin de preparaten zitten. Plaats het rek vervolgens in een glazen of metalen bak met chloroform in een zuurkast. Herhaal de wasbeurt met een tweede bak met verse chloroform.

Doop vervolgens het rek in een oplossing van 0,1% beta-mercaptoethanol plus twee keer SSPE om de dekglasjes los te maken en overtollige hybridisatielosung op te lossen. Breng de dia’s vervolgens over naar een tweede oplossing van verse 0,1% beta-mercaptoethanol plus twee keer SSPE. Plaats de dia's zonder dekglas in een nieuw rek in een tray met 0,1% beta-mercaptoethanol in twee keer SSPE en laat dit één uur incuberen bij kamertemperatuur om overtollige ongebonden RNA-probes te verwijderen.

Breng het rek met coupes vervolgens over naar voorverwarmde 2× SSPE plus 50% vormaline-oplossing bij 65 °C, met β-ME en ethanol tot een eindconcentratie van 0,1%, en incubeer dit gedurende één uur bij 65 °C. Gooi na de incubatie deze en alle voorgaande waterige wasoplossingen, evenals de dekglasjes, weg als radioactief afval. Was de coupes daarna twee keer in voorverwarmde 0,1× SSPE bij 65 °C gedurende telkens 30 minuten.

Dehydrateer vervolgens het weefsel via een serie van 70%, 95% en 100% ethanol gedurende twee minuten in elke oplossing. Droog de objectglaasjes tenslotte gedurende ten minste 30 minuten in een zuurkast. Eerst om te bepalen of er een radioactief signaal in het weefsel aanwezig is.

Plaats de gedroogde coupes in een filmcassette; werk in een donkere kamer met een veiligheidslamp en plaats de röntgenfilm over de coupes. Zorg ervoor dat de coupes naar de emulsiezijde van de film zijn gericht en sluit vervolgens de cassette. Stel de coupes één tot zeven dagen lang bloot aan de film, afhankelijk van de verwachte abundantie van de transcripten.

Nadat de belichting is voltooid, wordt de röntgenfilm ontwikkeld in standaard ontwikkelaar en fixer. Het hybridisatiesignaal verschijnt als zwarte gebieden op de film als gevolg van belichte zilverkorrels in de emulsie om de cellulaire resolutie te bepalen en het signaal op het weefsel zelf te kunnen zien. De preparaten worden gedoopt in fotografische emulsie en vervolgens tegengekleurd.

Als de coupes tegengekleurd moeten worden met kristalviolet, dan moeten de secties worden gedeliquidiseerd volgens de instructies in het geschreven protocol. Giet op dit punt, terwijl u in de donkere kamer werkt, gedestilleerd water in een buisje. Schep een hoeveelheid NTB-emulsie uit en verdun de emulsie met gedestilleerd water in een verhouding van één-op-één.

Nadat de emulsie gedurende 20 tot 30 minuten is gesmolten in een waterbad van 42 °C, wordt deze overgebracht naar een glazen dompelcontainer in een waterbad van 42 °C gedurende 20 tot 30 minuten. Het niveau van de verdunde emulsie moet nu alle secties op een objectglas bedekken wanneer het objectglas erin wordt gedompeld. Indien er veel objectglazen zijn, kan extra emulsie nodig zijn.

Dompel de objectglazen nu in de verdunde emulsie in een waterbad van 42 °C, en droog de gedompelde objectglazen vervolgens gedurende de nacht in een gesloten, lichtdichte container in de donkere kamer of in een oven bij 37 °C gedurende twee tot drie uur met de lichten uit. Breng de objectglazen na het drogen over naar een objectglbaksje. Dicht de randen af met zwart isolatietape en bedek het geheel vervolgens met aluminiumfolie.

Bewaar de doosjes gedurende enkele dagen tot weken bij vier graden Celsius; wanneer ze ontwikkeld moeten worden, laat de dia's opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder vervolgens, terwijl u in de donkere kamer werkt, het rek met de dia's uit de doosjes en ontwikkel deze in de codec D 19 ontwikkelaar bij 16 graden Celsius gedurende drie tot vijf minuten. Was daarna de ontwikkelde dia's gedurende één minuut in kraanwater bij kamertemperatuur.

Incubeer de coupes vervolgens twee keer in de fixeeroplossing bij 19 °C gedurende zes minuten per keer; tijdens de tweede fixatie mogen de kamerlampen worden ingeschakeld. Was de coupes nu in stromend water bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten. Schraap vervolgens met een scheermesje de emulsie van de achterzijde van de coupe terwijl deze nog nat is.

Tegenkleur ten slotte met 0,3% kristalviolet en dehydrateer vervolgens de preparaten en monteer deze indien nodig volgens de instructies in het geschreven protocol. Verwijder daarna eventuele overtollige emulsie op de achterzijde van de objectglazen door deze nat te maken met water en af te schrapen met een scheermesje. Spoel de objectglazen in een 80% ethanoloplossing en veeg ze één tot twee keer voorzichtig af om vuil en stof te verwijderen.

Maak foto's onder donkerveld- of helderveldverlichting. De stappen voor het schrapen en reinigen moeten mogelijk twee tot drie keer worden herhaald om goede beelden zonder stofdeeltjes te verkrijgen, die onder een dissectiemicroscoop in donkerveld gemakkelijk zichtbaar zijn. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van autoradiografie van in situ hybridisatie op röntgenfilms.

Deze röntgenfilm toont een sagittale doorsnede van de gehele kop van een zebravisvink op embryonale dag 10, die is gehybridiseerd met een antisense riboprobe voor Fox P1. De zwarte belichte korrels op de film tonen de expressie van boodschapper-RNA; zoals binnen de vier hersenen te zien is, is Fox P1 boodschapper-RNA hier verrijkt in het mesopallium, striatum en de dorsale thalamus. De röntgenfilm toont een doorsnede van dezelfde zebravisvink die is gehybridiseerd met de antisense riboprobe voor Cupre.

TF twee Co. TF twee is verrijkt in het gebied van het palam alium en meer ventrale thalamus. De volgende afbeeldingen zijn voorbeelden van autoradiografie van in situ hybridisatie vanuit emulsiedip-preparaten. Deze darkfield-afbeelding, gemaakt onder een dissectiemicroscoop, toont een sagittale doorsnede van de gehele kop van een zebravisch op dag zes na het uitkomen, die is gehybridiseerd met een antisense RIBA-probe voor Fox P one.

De witte blootgelegde zilkerkorrels in de emulsie boven het weefsel tonen de expressie van messenger-RNA. De rode kleur representeert de kleuring met kresselviolet. De schaalbalk staat voor één millimeter.

Hier toont de afbeelding een sectie van dezelfde zangvogel (zebra finch) die is gehybridiseerd met een antisense ribo-probe tegen coop TF two. De volgende afbeeldingen vergelijken antisense- en sense-labeling, wat verschillende patronen laat zien via autoradiografie op röntgenfilms van sagittale kopsecties van zebra finches op embryonale dag 12. De stippellijn geeft de contour van de gehele hersenen aan en de C markeert het cerebellum.

Er is te zien dat de antisense-streng van PAC six tot expressie komt in de hersenen, in het bijzonder in de ventriculaire zone. Deze aangrenzende sectie, gehybridiseerd met de sense-streng van PAC six, vertoont geen achtergrondexpressie in de gehele kop van het embryo, maar wel een duidelijke expressie in de pigmentlaag van het netvlies, vergelijkbaar met de antisense-streng. De volgende afbeeldingen tonen in C twee signalen van genexpressie en emissiedip-preparaten van de hersenen van een goudgors tijdens late embryonale stadia, weergegeven in brightfield- en darkfield-weergaven.

Deze brightfield-afbeelding toont de expressie van D one B op embryonale dag 10. Bij een normale belichting van de emulsie is het label, dat zwart verschijnt, bij deze vergroting nauwelijks zichtbaar. Deze afbeelding toont een identieke sectie en vergroting als in de vorige afbeelding, maar overgeschakeld naar dark field-weergave, waarbij de labeling in het striatum en thalamus in het wit wordt weergegeven.

Deze bright-field afbeelding toont de expressie van slit3 op embryonale dag 12. Na overbelichting van de emulsie is de zwarte label duidelijk zichtbaar. SC markeert de positie van het ruggenmerg en CB markeert de positie van het cerebellum.

Rostraal is naar links georiënteerd. Het hier getoonde beeld is een identiek coupesniveau bij dezelfde vergroting, maar weergegeven in donkerveldweergave, waarbij de labeling in het ruggenmerg in wit verschijnt en overeenkomt met het helderveldbeeld. De volgende afbeeldingen tonen de resolutie van de zilverkristallen op cellulair niveau.

Hier wordt de labeling van Fox P1 messenger-RNA in de voorhersenen van de zebravisch getoond; zilverkristallen verschijnen als zwarte stippen boven cellen die zijn gekleurd met kristalviolet. Deze afbeelding toont een hoge expressie over individuele cellen in het mesoalium van de volwassen zebravisch. Deze afbeelding toont een lage expressie over individuele cellen in het aangrenzende alium van dezelfde sectie.

Hi Fox. P1-messenger RNA-expressie in cellen wordt waargenomen in het meso-alium op embryonale dag 12.

De embryonale cellen die hier te zien zijn, zijn kleiner en dichter op elkaar gepakt in vergelijking met de volwassen cellen in de voorgaande twee afbeeldingen. Tot slot laat deze afbeelding een lage expressie zien over cellen in het aangrenzende alium van dezelfde sectie. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunochemie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals in welk celtype het doelgen tot expressie komt.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de hybridisatie in het instituut uitvoert. Vergeet niet dat het werken met radioactieve reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals persoonlijke beschermingsmiddelen, tijdens deze procedure altijd moeten worden getroffen.