Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen

Deze video demonstreert een methode waarbij UV-licht wordt gebruikt om de activiteit van een eiwit aan het plasmamembraan te manipuleren. Hiervoor worden cellen cotransfecteerd met membraanverankerd FRB-eiwit en het met FKBP gefuseerde eiwit van belang. Een fotogecaged rapamycine-derivaat wordt aan het medium toegevoegd.

Vervolgens wordt tijdens live-cell imaging UV-licht toegepast op een specifiek deel van de cel. De linker tussen rapamycine en biotine wordt gesplitst, waarbij de chemische dimerisator en het bijproduct vrijkomen; de vrijgegeven dimerisator diffundeert de cellen in en induceert dimerisatie tussen het met FKBP gelabelde eiwit van belang en het aan het plasmamembraan verankerde FRB in het bestraalde gebied. Zonder de UV-straling associëren FKBP en FRB niet, waardoor er geen effect optreedt.

Analyse van de gegevens onthult een sterk gelokaliseerde rekrutering van het gefuseerde FKBP-eiwit van belang, gebaseerd op het fysiologische effect ervan. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals farmacologische en genetische benaderingen, is de combinatie van snelheid van actie, doelspecificiteit en ruimtelijke resolutie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van kanker bij metastase als gevolg van migratie door kankercellen.

Daarom kan manipulatie van de activiteit van sleutelmigratiefactoren het preciese moleculaire mechanisme onthullen, wat een voorwaarde is voor de behandeling en genezing ervan. De procedure zal worden gedemonstreerd door Chris Paul Meyer, een promovendus, en Bob de Rose, een laborant uit mijn laboratorium. Begin dit protocol door het volgende in een steriele microcentrifugeebuis te combineren: plasmide-DNA, membraangebonden FRB, fluorescent gelabeld FKBP, TIA one en gedeïoniseerd water; voeg 1 µL a few gene HD toe aan het mengsel en vortex.

Incubeer de buis 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg tijdens de incubatie 50 µL poly-L-lysine toe aan elke put van een glazen chamber slide met acht putten en incubeer dit gedurende één minuut om het oppervlak te coaten; aspireer vervolgens de oplossing en was het midden van elke put met 50 µL gedeïoniseerd water. Vervolgens wordt trypsine toegevoegd aan NIH 3T3-cellen met een confluentie van 80 tot 85%.

Nadat de cellen zijn losgekomen, voegt u 10 milliliters DMEM toe met 10% FBS, brengt u 375 microliters van de suspensie over naar een steriele buis van 15 milliliter en centrifugeert u dit gedurende drie minuten bij 1.500 G. Aspireer na het centrifugeren voorzichtig het medium. Voeg 750 microliters DMEM toe met 10% FVS en resuspendeer.

Resuspendeer het pellet door voorzichtig meerdere keren met de pipet op en neer te pipetteren. Voeg tenslotte de celsuspensie toe aan de transfectie-oplossing en roer voorzichtig met de pipetpunt; voeg vervolgens 250 microliters van de celtransfectiesuspensie toe aan elke put van de kamer. Schuif het geheel op zijn plaats en incubeer het.

37 °C gedurende 15 tot 18 uur. Om cage-rapamycine, biotin-adduct te synthetiseren: begin met het bereiden van een stokoplossing van 1 mM CRB in DMSO in een steriele centrifugebuis; los in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 mL één mg avadon op in 250 µL PBS.

Vervolgens wordt het caging-gedeelte geconjugeerd aan rapamycine. Voeg 0,5 µL van de CRB-stoomoplossing toe aan het opgeloste AVID; meng dit door het buisje enkele keren om te keren en laat het daarna 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Om CRB AVID als conjugaatoplossing te verkrijgen, ongebonden kleine moleculen te verwijderen en CRBA te zuiveren, wordt een G 25 size-exclusion kolom geëquilibreerd met 300 µL PBS.

Herhaal dit vijf keer nadat de kolom is geëquilibreerd. Breng 125 µL CRBA-oplossing aan op het centrale bed van de kolom. Centrifugeer de oplossing vervolgens gedurende twee minuten bij 800 ×g. Verzamel de doorstroom bij kamertemperatuur in een 1,5 mL microcentrifugebuis na transfectie van de cellen.

Vervang het medium door DMEM zonder FBS om de cellen te serumuithongeren en laat deze 12 uur incuberen. Zuig na de incubatie voorzichtig het medium af en voeg 250 µL van de bereide 1 µM CRBA-oplossing toe. Gebruik vervolgens, om de proteinedynamiek in levende cellen te visualiseren, een spinning disc confocale microscoop met UV-verlichting, waarbij de optica zijn gekoppeld aan een UV-LED-lichtbron van 365 nm.

Met epifluorescentielicht. Bepaal de coördinaten en de grootte van een belichtingsspot met behulp van een glasplaat gecoat met fluorescerende kleurstoffen die door UV-licht worden geëxciteerd. Dit maakt een nauwkeurige afstelling van het te bestralen gebied mogelijk.

Plaats de kamerdia met de cellen op de tafel met gebruik van een 100 x objectief en epifluorescentie. Stel de cellen scherp en zoek een cel. Begin met het afbeelden van de cellen nadat de achtergrondniveaus van het fysiologische effect zijn bepaald.

Hierbij wordt membraanruffling gemeten door UV-licht uit te stralen in één gekozen kwadrant van de cel, waarbij uncaged rapamycine wordt opgelost in DMSO en vervolgens in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 400 nanomolar. Voeg 100 microliter van de oplossing toe aan de beeldvormingskamer om globale effecten op te wekken. Leg elke 15 seconden fluorescentiebeelden vast gedurende 20 minuten om vast te stellen of gelokaliseerde activatie van RAC lokale rufflevorming kan induceren.

NIH 3T3-cellen werden getransfecteerd met YFP-getagde RAC-activator FKbp, TIA1 en LDR, welke membraanverankerd is. FRB-gelokaliseerde bestraling aan de rand van de cel, aangegeven door de gele cirkel, werd gevolgd door globale illuminatie met een kwiklamp gedurende één seconde, beginnend bij 1063 seconden. Zoals hier te zien is, was er aan het begin vrijwel geen membraanruffling aanwezig.

Echter, na lokale illuminatie werd ruimtelijk beperkte ruffling waargenomen na globale illuminatie en toevoeging van rapamycine, wat translocatie van FK bp TIA one naar het plasmamembraan veroorzaakt. De cel vertoonde globale ruffelvorming, wat aangeeft dat de eerder waargenomen lokale ruffelvorming werd veroorzaakt door ruimtelijk beperkte activatie van rack. Voor een kwantitatieve analyse werden doelcellen verdeeld in vier kwadranten en werd de frequentie van ruffelvorming in elk kwadrant bij zowel lokale als globale stimulatie bepaald, zoals te zien is in deze grafiek.

Geen van de geobserveerde cellen vertoonde rimpelvorming met CRBA zonder uv-bestraling of lokale uv-bestraling, noch uv-bestraling met of zonder Aden in bulkmedium. Echter, wanneer CRBA werd toegevoegd en uv-bestraling werd uitgevoerd, was rimpelvorming te zien in ongeveer dezelfde mate, ruwweg 90% in alle kwadranten bij globale bestraling; wanneer alleen kwadrant één werd bestraald, was de frequentie van rimpelvorming 100% vergeleken met 30%, 25% en 30% in kwadranten twee tot en met vier. Deze resultaten geven aan dat gelokaliseerde uncaging van rapamycine kan worden gebruikt om zeer lokale fysiologische effecten in een enkele cel op te wekken.

In dit geval is er sprake van membraanruffeling veroorzaakt door rack-activatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe spatiotemporele controle van de activiteit van kleine g TPAs door middel van licht kan worden bereikt. Deze methode kan worden toegepast op elk fysiologisch proces dat afhankelijk is van de translocatie van specifieke eiwitten naar het plasmamembraan.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat oplossingen, reagentia en cellen voor elke procedure vers moeten worden bereid. Vergeet niet dat werken met UV-licht extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een UV-bril, altijd moeten worden in acht genomen.