Methoden om Assay Drosophila Gedrag

Het algemene doel van deze procedure is om methoden aan te tonen voor het onderzoeken van het motorisch-sensorisch gedrag en de coördinatie van drosophila. Dit wordt bereikt door eerst de motorische functie van larven te beoordelen met de kruiptest, de motorische functie van volwassenen te beoordelen met de ringtest, en de coördinatie en sensorische vermogens van volwassenen te beoordelen met de hofmakerijtest. Uiteindelijk kan dit panel van gedragstests aantonen hoe genetische en externe factoren, zoals medicijnbehandelingen, de activiteit en coördinatie kunnen beïnvloeden.

Intra sophala. Het belangrijkste voordeel van deze assay ten opzichte van bestaande methoden zoals negative geo axis, is dat de ring-assay een hogere doorvoer heeft en gevoeliger is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van neurodegeneratieve ziekten, zoals de vroege detectie van locomotiedefecten.

Deze assay zal worden gedemonstreerd door Dr. Jamie Becknell, postdoc in mijn laboratorium. De larval crawling assay wordt gebruikt om het effect van genetische en omgevingsfactoren op de mobiliteit te meten. Om te beginnen wordt een kruising opgezet met 10 tot 15 mannetjes en 10 tot 15 maagden in een standaardfles. Na 24 uur zullen gezonde volwassenen voldoende eieren hebben gelegd om de fles te vullen, zodat deze populatie een gelijke leeftijd van 24 uur heeft.

Verplaats de volwassenen naar een nieuw flesje en herhaal het proces. Incubeer het flesje vervolgens totdat er larven in het derde stadium in het voedsel in het flesje worden waargenomen. Voeg 50 tot 100 milliliters 20%sucrose toe en laat dit 20 minuten staan.

De larven zullen naar de oppervlakte drijven; verzamel de larven met een serologische pipette van 25 milliliter waarvan de punt is afgesneden en plaats ze in een maasmandje. Was de larven in het maasmandje twee keer met gedeïoniseerd water. Ze kunnen nu worden gebruikt voor experimenten.

Om de larven met een geneesmiddel te behandelen, gebruikt u een penseel om het gewenste aantal larven over te brengen naar een bekerglas van vijf milliliter met een oplossing van 5% sucrose en het betreffende geneesmiddel. Laat ze 15 minuten lang voeden met de suikeroplossing die het geneesmiddel bevat, giet ze vervolgens terug door de zeefmand, spoel ze af en ga verder met het meten van het effect van het geneesmiddel op de mobiliteit. Gebruik een penseel om een individuele larve over te brengen naar een Petrischaal van 15 centimeter met 2% agarose.

Plaats dit over een vel ruitjespapier. Verzamel nu de gegevens. Tel simpelweg het aantal rasterlijnen dat de lava in één minuut oversteekt.

Gebruik vervolgens het penseel om de larven gedurende een periode van één minuut onder een dissectiemicroscoop over te brengen naar de put van een glazen dissectieschaal met een verdunde gistpastaoplossing en tel de contracties van de Percy's. Een enkele contractie wordt geteld als een volledige beweging van posterieur naar anterieur. Herhaal dit tot het gewenste aantal larven is geteld.

Het ringprotocol meet de voortbewegingssnelheid van volwassen dieren. Verzamel pas uitgekomen volwassen mannelijke vliegen onder lichte anesthesie en breng deze over naar een standaard buisje met normaal of met geneesmiddelen behandeld voedsel. Plaats ongeveer 25 vliegen per buisje. Houd de vliegen twee tot drie dagen op kamertemperatuur voor een volledig herstel van de anesthesie en het bereiken van een steady-state drugspiegel.

Breng vervolgens ongeveer 25 vliegen zonder anesthesie over naar polystyreen vials met gegoten pluggen en plaats de vials in één of meer ringapparaten. Laat de vliegen 15 tot 20 minuten rusten terwijl u een digitale camera uitlijnt om de vials vanaf de zijkant te fotograferen; houd een timer gereed en stel deze in op de gewenste duur voor de assay. Meestal is drie seconden voldoende om de assay uit te voeren.

Houd de ringapparatuur in één hand zonder de vliegen te storen en houd de cameratimer stevig in de andere hand. Tik drie keer met de apparatuur op de werkbank om de vliegen neer te slaan en start gelijktijdig de afteltimer van de camera. Herhaal de test één keer per minuut totdat er vijf of zes proeven zijn uitgevoerd.

Het is van cruciaal belang om de polystyreen testbuisjes niet opnieuw te gebruiken nadat de initiële datasets zijn verzameld. Vliegen die in gebruikte buisjes worden geplaatst, zullen namelijk niet in dezelfde mate klimmen als vliegen die in nieuwe buisjes worden geplaatst. Om de gegevens met behulp van een image viewer te verzamelen, wordt de gemiddelde klimhoogte per groep gescoord.

Voor deze assay zijn genetische kruisingen in flessen vereist die overvloedig nageslacht produceren, zodat er voldoende vliegen verzameld kunnen worden. Maak de flessen binnen enkele uren na het subjectieve ochtendgloren van de dieren leeg om alle volwassenen in intervallen van drie tot vier uur te verzamelen. Verzamel pas uitgekomen, seksueel naïeve mannetjes en vrouwtjes; huisvest de mannetjes individueel in vials of buisjes met voedsel en de vrouwtjes in groepen van vijf tot zes.

Voor de assay zijn in soortgelijke behuizingen gelijke aantallen mannetjes en vrouwtjes vereist. Nadat de verzamelde vliegen vijf dagen zijn geïsoleerd, worden zij klaargemaakt voor plaatsing in een paringswiel om de assay uit te voeren. Breng vervolgens onder een dissectiemicroscoop zorgvuldig één vrouwtje en één mannetje over naar de kamer van een paringswiel.

Observeer het paar gedurende 10 minuten of tot ze in die tijd succesvol copuleren. Noteer wanneer elk van de verschillende gedragingen voor het eerst wordt waargenomen. Noteer wanneer het mannetje zich voor het eerst naar het vrouwtje keert.

Registreer wanneer het mannetje het vrouwtje voor het eerst met zijn poot aanraakt, wanneer het mannetje voor het eerst een vleugel uitstrekt en laat trillen, en wanneer het mannetje de genitaliën van het vrouwtje voor het eerst likt. Registreer wanneer het mannetje zijn abdomen voor het eerst onder zich krult. Registreer wanneer het mannetje voor het eerst probeert op het vrouwtje te klimmen. Registreer tot slot de totale tijd die wordt besteed aan hofmakerijgedrag tot aan de copulatie.

Voor wild-type dieren is dit bijna altijd binnen vijf tot 10 minuten; verzamel gegevens aan de hand van drie verschillende parameters. Ten eerste is de latentie van een gedrag de tijd die verstrijkt voordat het voor het eerst wordt waargenomen. Ten tweede is de frequentie van een gedrag of het nu wordt waargenomen of niet.

Ten derde is de courtship-index de tijd besteed aan het hofmakingsgedrag gedeeld door de totale tijd tot aan de copulatie in een experiment met dieren. Het dragen van mutaties in F-U-S-T-L-S is gerelateerd aan amyotrofische laterale sclerose. Genmutanten met een insertie in het centrum vertoonden de helft van het kruipvermogen van de wildtype-controles links, en een R 5 21 C missense-mutatie verlaagde de kruipsnelheid tot slechts ongeveer one centimeter per minuut.

Ringtesten bij jonge wilde-type volwassen vliegen resulteerden in een gemiddelde hoogte waarbij ze tussen de drie en vijf centimeter klommen over een tijdsperiode van drie seconden. In deze assay werd geen desensitisatie waargenomen tijdens maximaal vijf opeenvolgende pogingen met een tussenpoos van één minuut bij het uitvoeren van de ringassay. Het is belangrijk om te onthouden dat men zo nauwkeurig mogelijk moet zijn met betrekking tot de timing.

Zodra de methode onder de knie is, kan de larval crowding assay in 30 tot 40 minuten worden uitgevoerd om 10 tests voor één genotype te observeren, mits dit correct wordt gedaan. Na het bekijken van deze video zou u ook een goed begrip moeten hebben van hoe u hofmakeringsgedrag bij de vlieg observeert en scoort.