Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren en kwantificeren van de verschillende subpopulaties gespecialiseerde cellen die differentiëren in biofilms van het modelorganisme, bacillus subtles. Dit wordt bereikt door eerst transcriptionele reporters in het chromosoom van B subtles in te voegen. Deze reporters zullen uitsluitend tot expressie komen in de subpopulatie cellen die wordt bestudeerd.

De volgende stap is het bevorderen van de ontwikkeling van een biofilm door B subtles te kweken in het biofilm-inducerende medium, Ms GG gg. Na de biofilmvorming worden de cellen uit de biofilm gedispergeerd en gefixeerd met paraformaldehyde. De laatste stap van de procedure is het detecteren van het fluorescentiesignaal dat wordt uitgezonden door individuele cellen van de microbiële gemeenschap met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Uiteindelijk laten de resultaten zien hoe cellen gespecialiseerd zijn in productie en secretie. De extracellulaire matrix die de biofilm vormt, wordt geproduceerd door een andere subpopulatie dan de cellen die surfactant secreteren, het signaalmolecuul dat verantwoordelijk is voor de differentiatie van de subpopulatie matrixproducenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de kwantificering van transcriptionele expressie met behulp van viability-assays of microarray-analyse, is dat het ons in staat stelt om genexpressie op single-cell niveau te monitoren en bijzonder kleine populaties cellen te visualiseren die gespecialiseerd zijn in de expressie van een specifiek gen.

Deze genexpressies zullen niet worden gedetecteerd bij analyse van de totale populatie. Integratieve plasmiden worden gebruikt voor het labelen van B-subtielen en een voorbeeld hiervan wordt hier getoond. PTAA, de promoter van de genen die verantwoordelijk zijn voor de productie van tass.

Een matrixeiwit wordt in de vector gekloneerd met behulp van de restrictieplaatsen EcoRI en HindIII. De expressie van het CFP-reportergen staat nu onder controle van ptap A. Om te beginnen met de procedure voor het labelen van B. subtilis, wordt het integratieve plasmide gelineariseerd door middel van enzymatische digestie. Het aanbevolen restrictie-enzym is XhoI. Wanneer het integratieve plasmide gereed is, wordt natuurlijke competentie geïnduceerd in B. subtilis stam 168 door de cellen vijf uur lang bij 37 °C te kweken in competentie-inducerend medium.

Voeg het gelineariseerde plasmide toe aan de cultuur van competente B. subtilis-cellen en incubeer deze gedurende twee uur bij 37 °C. Plaat de cellen na twee uur op agar met spectinomycine en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Het chromosoom van B. subtilis heeft twee neutrale loci, AmyE en LAC A, die gebruikt kunnen worden om reporterfusies te integreren zonder de ontwikkeling van de biofilm te beïnvloeden. Het gelineariseerde PKM 0 0 8-plasmide integreert in het genoom van B. subtilis via dubbele recombinatie.

De volgende stap is om de reporter over te brengen van de gemarkeerde stam naar een stam die in staat is om biofilms te vormen met behulp van het SPP one fage-transductieprotocol. Voor de doeleinden van deze video worden alleen de belangrijkste stappen in het protocol getoond. Kweek de donorstam 1 68, die de reporterfusie bevat, in TY-medium bij 37 °C totdat de cultuur de vroege stationaire fase bereikt, met 200 µL cellen tegenover 100 µL verdunde fagevoorraad in een glazen buis.

Laat dit vervolgens 15 minuten staan bij 37 °C. Pipetteer daarna hete TY soft agar in de buis en meng dit grondig door middel van vortexen. Verdeel dit voorzichtig over een nieuwe TY-plaat en incubeer bij 37 °C gedurende 8 tot 16 uur om de vorming van faaghalo's mogelijk te maken.

Om de faaghalo's te verzamelen, voegt u drie milliliter TY-medium toe aan de plaat en gebruikt u de glaspipet om de bovenste agarlagen op te breken. Draag de agarsuspensie over naar een Falcon-buis van 15 milliliter. Vortex zachtjes om de agar verder op te breken en centrifugeer vervolgens bij 1000 G gedurende 15 minuten.

Overbreng de supernatant naar een nieuwe buis. Filtreer de supernatant door een spuitfilter van 22 micron. Gebruik deze supernatant om een cultuur van de ontvangende stam, gegroeid in TY-medium, te infecteren.

Voeg 30 µL supernatant toe aan 10 mL cultuur verdund 1:10 en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Centrifugeer daarna 7 minuten bij 5.000 RPM, resuspendeer de pellet in 200 µL TY-medium en strijk dit uit op een plaat met spectinomycine plus 10 mM natriumcitraat.

Incubeer gedurende 12 tot 36 uur bij 37 °C. Selecteer een kolonie en kweek deze gedurende een nacht in vloeibaar LB bij 37 °C. Spot ten slotte drie µL van de overnacht gekweekte cultuur op vast medium dat biofilminductie stimuleert.

Laat de cellen 72 uur groeien bij 30 °C. Na drie dagen groei zullen biofilms die op het oppervlak van de Ms.GG-agar zijn gevormd, een complexe morfologische architectuur op het agaroppervlak ontwikkelen. Om deze procedure te starten, gebruikt u een tandenstoker of een pincet om de biofilm van het oppervlak van de MSGG-agar te verwijderen.

De consistentie van de biofilm moet zodanig zijn dat deze van het agar-oppervlak kan worden afgepeld. Plaats de biofilm in één stuk in drie milliliters PBS-buffer en dispergeer de biofilm voorzichtig. Voer 12 pulsen uit met een output van drie en een amplitude van 0,7 seconden om de monsters te fixeren voorafgaand aan de analyse van individuele cellen.

Resuspendeer 300 µL van de cel-suspensie in één milliliter van een 4% paraformaldehydeloplossing en incubeer dit gedurende precies zeven minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen na de fixatie van zeven minuten drie keer met PBS-buffer. Resuspendeer de cellen tot slot in 300 µL PBS-buffer vóór fluorescentiemicroscopie.

Bereid een microscoopdia voor door 200 µL 0,8% agros op de dia te pipetteren en deze voorzichtig af te dekken met een andere dia. Verwijder na twee minuten voorzichtig de bovenste dia om een laag agros op de onderste plek van de dia te verkrijgen. Pipetteer twee µL gefixeerde cellen op het oppervlak van de agroslaag en dek dit af met een dekglas.

Plaats het monster op de tafel van de fluorescentiemicroscoop. Stel de excitatieperiode in op basis van een negatieve controle die geen fluorescentie vertoont onder de voor het experiment gekozen condities. De belichtingstijd moet tussen de 50 en 200 milliseconden liggen.

Neem voor elk gezichtsveld zowel een fluorescentiebeeld als een brightfieldbeeld op. Om de cellen voor flowcytometrie-analyse voor te bereiden, worden de gefixeerde cellen gedispergeerd door middel van milde sonicatie. Voer twee series van 12 pulsen uit met een output van vijf en een amplitude van 0,7 seconden om klonters te dispergeren tot enkelvoudige cellen zonder cellyse te veroorzaken.

Bevestig de efficiëntie van de celdispersie via lichtmicroscopie. Verdun vervolgens het monster 1:100 in PBS-buffer. Voor deze analyse van de YFP-fluorescentie wordt een BD fax canto two flowcytometer gebruikt.

Een laser-excitatie bij 488 nanometer gekoppeld aan een 5 30 30 filter wordt gebruikt voor CFP-fluorescentie. Een laser-excitatie bij 405 nanometer gekoppeld aan een 4 0 8 40 filter wordt gebruikt; kalibreer de flowcytometer met twee negatieve controles. Een monster van PBS-buffer zonder cellen in suspensie dient als negatieve controle voor de grootte van het deeltje dat door de flowcytometer wordt gedetecteerd.

Een monster zonder fluorescerende reporter moet dienen als negatieve controle voor de fluorescentgevoeligheid van de flowcytometer. Plaats na kalibratie het monster dat is gelabeld met een fluorescerende reporter in de flowcytometer; analyseer voor elk monster ten minste 50.000 events met een flowrate tussen de 303.000 events per seconde. Wanneer B. subtilis groeit op een plaat met biofilm-inducerend medium, wordt MSGG-biofilmvorming waargenomen na drie dagen incubatie bij 30 °C.

De biofilm vertoont een complexe morfologische architectuur die indicatief is voor de verschillende deelnemende cel-subpopulaties. Zo leidt de productie van de extracellulaire matrix en biofilms tot de vorming van rimpelingen op het oppervlak van de kolonie. Deze figuur toont een voorbeeld van de visualisatie van celdifferentiatie in een enkele gelabelde stam met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Deze stam bevat de fluorescerende reporter Ptap, A CFP, die tot expressie komt in de subpopulatie van matrixproducerende cellen, weergegeven in het blauw. Deze subpopulatie produceert en scheidt de extracellulaire matrix uit die de biofilm vormt. De volgende afbeelding is het resultaat van visualisatie via fluorescentiemicroscopie van een dubbel gelabelde stam die de reporter Ptap, A CFP en de aanvullende reporter P Surfactin YFP bevat.

Deze tweede reporter maakt het mogelijk om de subpopulatie cellen te monitoren die verantwoordelijk is voor de secretie van het signaalmolecuul surfactine, dat de signaalcascade voor de differentiatie van de matrixproducenten activeert. Hier zijn de matrixproducenten valsgekleurd in blauw, terwijl de surfactineproducenten valsgekleurd zijn in geel, de resultaten van 2D-flowcytometrie met gebruik van een enkele gelabelde stam die de reporter ptap bevat. Een YFB wordt hier gepresenteerd.

De onbehandelde controlestam zonder fluorescerende proteïnegenen vertoonde een enkele populatie met een lage relatieve fluorescentie van cellen die ptap bevatten. Een YFP onder niet-biofilminducerende omstandigheden differentieerde de subpopulatie van matrixproducenten niet, en de gehele populatie vertoonde eveneens een lage relatieve fluorescentie. In tegenstelling hiermee werd onder biofilminducerende omstandigheden een subpopulatie cellen met een hoge relatieve fluorescentie gedetecteerd als een schouder rechts van de lage relatieve fluorescentie.

Hier worden de piekresultaten getoond die met 3D-flowcytometrie zijn verkregen. De fluorescentiesignalen van de gemonitorde kanalen worden weergegeven op de X-as voor YFP en op de Y-as voor CFP; het linkerbovenpaneel toont een stam zonder fluorescenteproteïne-genen als controle voor achtergrondfluorescentie. In het rechterbovenpaneel is een enkele gelabelde stam gebruikt om de subpopulatie van surfactine-producenten te detecteren in het YFP-fluorescentiekanaal, omkaderd in geel.

In het linkerpaneel onderaan werd een andere enkel gelabelde stam gebruikt om de subpopulatie van matrixproducenten te detecteren. In het blauw omkaderde CFP-fluorescentiekanaal worden de subpopulaties van matrixproducenten en surfactantproducenten gemonitord met behulp van de dubbel gelabelde stam, en de resultaten hiervan worden in dit rechterpaneel onderaan gepresenteerd.

Er worden twee subpopulaties cellen gedetecteerd die hoge niveaus van de fluorescente reporters tot expressie brengen. Elke populatie is omkaderd om aan te tonen dat er geen overlap is in de expressie van de reporters tussen de twee subpopulaties gespecialiseerde cellen. Deze laatste figuur toont de kwantificering van de subpopulaties matrixproducenten en kannibalen middels 3D-flowcytometrie.

In het rechterbovenpaneel is een enkele gelabelde stam gebruikt om de subpopulatie kannibalen te detecteren. In het in geel omkaderde YFP-fluorescentiekanaal is beschreven dat deze subpopulatie kannibalen zich gecoördineerd onderscheidt van de subpopulatie matrixproducenten. In het linkeronderpaneel wordt de subpopulatie matrixproducenten gedetecteerd in een andere enkele gelabelde stam in het CFP-fluorescentiekanaal.

In het blauwe kader tonen de resultaten van de dubbel gelabelde stam in het rechteronderpaneel een enkele subpopulatie van fluorescerende cellen die zowel YFP als CFP tot expressie brengen, omkaderd in het groen. De gelijktijdige expressie van de twee reporters geeft aan dat beide differentiatiepaden van cellen gecoördineerd worden geactiveerd in dezelfde subpopulatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de verschillende subpopulaties cellen die een microbiële biofilm vormen kunt visualiseren en kwantificeren met behulp van celanalyse van de celpopulatie, zoals fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie.