De ITS2 Database

Het ribosomale gen van de interne getranscribeerde spacer twee, of ITS2, is een van de belangrijkste markers in de moleculaire systematiek. Onderzoek van de afgelopen 20 jaar heeft zich hoofdzakelijk gericht op het benutten van ITS2-sequenties voor fylogenetische reconstructie. Echter, de secundaire structuur van ITS2 wordt om verschillende redenen steeds vaker gebruikt in het veld van de fylogenetische inferentie.

Analyse van de secundaire structuur breidt de taxonomische toepasbaarheid van deze marker uit, terwijl de snel evoluerende en daarom zeer variabele ITS2-sequentie vooral geschikt is voor fylogenetische analyse op soortniveau of lager. Het toevoegen van structurele informatie maakt gelijktijdige analyse op een hoger taxonomisch niveau mogelijk vanwege de sterk geconserveerde ITS2-secundaire structuur, bestaande uit vier karakteristieke ess'en. De resultaten van de analyse van de secundaire structuur kunnen dus de fylogenetische resolutie verbeteren die met de primaire sequentie wordt behaald.

Welkom, beste collega's, mijn naam is Matthias Wolf. Ik werk nu ongeveer acht jaar in het I ts two proof. Ik ben werkzaam bij de afdeling Bioinformatica van het bio center aan de Universiteit van Würzburg in Duitsland.

Vandaag willen we u een korte video presenteren over het gebruik van de ITS2-database. Hallo, ik ben y Chu. Het doel van deze video is om te laten zien dat de ITS2-database in feite niet alleen een database voor opslag is, maar dat we ook veel hulpmiddelen bieden waarmee u uw fylogenetische analyse kunt verbeteren.

In deze video willen we laten zien hoe u met deze hulpmiddelen werkt en hoe u al deze hulpmiddelen met elkaar verbindt. Correct. Afbakening van de ITS2-sequentie kan cruciaal zijn voor structuurvoorspelling. Daarom is er een webgebaseerde interface voor annotatie op basis van het hidden Markov-model geïmplementeerd.

Om een correcte annotatie van uw ITS2-sequenties te verkrijgen, kunt u deze plakken in de sequentie-editor bovenaan de website. Dit wordt gedemonstreerd door de voorbeeldsequenties van planten te laden. De sequentie-editor zelf controleert of uw ITS2-sequenties geldig zijn en geeft foutmeldingen weer.

Wanneer u bijvoorbeeld niet-PAC-karakters gebruikt, kunt u na het selecteren van het juiste HMM het proces starten door op 'annotate' te klikken. Elk 5.8 s en 28 SRNA dat door het programma kon worden geïdentificeerd, wordt verwijderd, waardoor de correct geannoteerde I ts twee-sequenties die daartussen waren gelegen, overblijven. Als resultaat worden zowel de afgebakende I TS twee-sequenties als het voorspelde hybride van 5.8 s en 28 S-R-R-N-A weergegeven. Om de nauwkeurigheid van de HMM-annotaties te bevestigen, kunnen na annotatie van de nieuw behouden I ts twee-sequenties de secundaire structuren op twee manieren worden bepaald.

De eerste voorspelling kan worden uitgevoerd via homologie-modellering, waarbij de volledige set sequenties en structuren van de database als sjablonen dient. Om de structuur van uw geannoteerde sequenties te voorspellen, klikt u op 'predict structure'. Als uw sequenties direct kunnen vouwen tot hun typische secundaire structuur, wordt het resultaat onmiddellijk weergegeven.

U kunt nu kiezen uit verschillende opties om uw sequentiestructuur verder te verwerken, waaronder het toevoegen ervan aan uw datapool. Als u hier bent omdat twee sequenties niet direct kunnen vouwen, wordt er een BLAST-zoekopdracht in de database uitgevoerd. De resulterende pagina toont de beste BLAST-hits, inclusief de homologie-modellering voor elk plastiek als template.

Door op het plusteken te klikken worden details weergegeven; u kunt de gewenste paren van sequentiestructuur selecteren en aan de datapool toevoegen, via sleep-en-neerzetten of met behulp van het contextmenu via de rechtermuisknop. Een tweede benadering is om handmatig één of meerdere sequenties in te voeren, inclusief hun secundaire structuren als sjablonen om de meest geschikte secundaire structuren over te dragen naar uw querysequenties. Dit wordt gedemonstreerd door het voorbeeldbestand voor meerdere sjablonen te laden.

Door op Predict best templates te klikken, voert u de homologiemodellering uit met de standaardinstellingen. Het homologiemodelleringprogramma zal alle structuren tegen elkaar berekenen en de beste combinaties van query-templates weergeven. In de resulterende tabel kunt u zien welke templates hun secundaire structuur succesvol konden gebruiken om één of meerdere query-sequenties te modelleren.

Ook hier kunnen de details van de resultaten worden geopend door op het plusteken te klikken, aangezien de volledige homologie-modelleringsbenadering onafhankelijk is van de I TS twee. Deze kan worden gebruikt om de secundaire structuur van elk RNA te voorspellen, mits er een homoloog molecuul met een bekende structuur beschikbaar is. Bovendien kunnen de resulterende sequentie-structuurparen via drag-and-drop of via het contextmenu, dat met de rechtermuisknop wordt geopend, aan de datapool worden toegevoegd.

Naast de algemene structuur zijn voor de ITS2 geconserveerde motieven beschreven, zoals de A-U-G-G-U sequentie voorafgaand aan de apex van de derde helix en een perine piramide bij een mismatch in de tweede helix. Deze UU mismatch wordt omringd door twee motieven, één links van helix twee en één rechts tussen helix twee en drie met een aanvullend triple A nucleotide. Nadat we deze sequentiemotieven hebben omgezet in hms, bieden we nu de identificatie van deze motieven in de sequenties van belang.

Om naar deze motieven te zoeken, voert u uw querysequentie in het zoekveld in en kiest u het juiste model. Opnieuw wordt dit gedemonstreerd door het voorbeeldbestand voor plannen te laden. Klik op motiefzoekopdracht om de berekeningen te starten.

De twee motieven van I ts zijn geannoteerd en gemarkeerd in uw querysequenties. Een mogelijkheid om de twee sequentiestructuurparen van I ts uit de I Ts-database op te halen, is de zoekfunctie. Hiermee kan de gebruiker zoeken naar sequentiestructuren op basis van de taxonnaam of de GenBank-identificatie.

Om naar een sequentiestructuur te zoeken op basis van een GenBank-identificatiecode, typt u de GI in het zoekveld en klikt u op zoeken. Er verschijnt een lijst met resultaten in een nieuw tabblad. U kunt de details van een sequentiestructuur bekijken door op details tonen te klikken.

Daarnaast kunt u de S-directe sequenties van alle hits binnen het tabblad weergeven door te klikken op 'toon sequentiestructuur per slepen en neerzetten', of via het contextmenu met een rechtermuisklik kunnen de gewenste sequentiestructuren aan de datapool worden toegevoegd. Naast het zoeken naar sequentiestructuurparen op gi, kunt u een taxonnaam in het zoekveld typen, wat wordt ondersteund door een verschijnend live zoekvenster. Nadat het nieuwe tabblad verschijnt met een lijst van alle hits, heeft u toegang tot dezelfde functies als voorheen.

Zo kan bijvoorbeeld via drag-and-drop een selectie aan de datapool worden toegevoegd. De tweede mogelijkheid om sequentie-structuurparen uit de database op te halen, is de browse-functie. Hier zijn de teksten gesorteerd.

Volgens de NCBI-taxonomiedatabase is de data toegankelijk via de boomstructuur aan de linkerzijde van de website. Door op het plusteken te klikken, kunt u de tekst één niveau lager weergeven.

Door op een taxonnaam te klikken, opent u een nieuw tabblad met elke sequentiestructuur en elk paar van het taxon. Naast een zoekopdracht naar sequenties en structuren met CEM-bankidentificatoren of soortinformatie, biedt de I Ts two-database ook een blast-gebaseerde zoekfunctie. Echter, standaard blast-procedures zijn vaak niet in staat om nauw verwante taxa te identificeren.

Het resultaat bestaat uit twee sequenties vanwege de hoge sequentiedivergentie. Om dit beletsel te overwinnen, hebben we een sequentie- en structuurgebaseerde blast-zoekopdracht geïmplementeerd die informatie over de sterk geconserveerde structuur bevat voor de homologiezoekopdracht. Dit wordt gedaan door de sequentiestructuur te vertalen naar een pseudo-eiwitsequentie van 12 letters.

Zo is soortbemonstering die begint met elke sequentie van belang en brede taxonomische bereiken bestrijkt, inmiddels net zo eenvoudig geworden als een blast-zoekopdracht. Om een blast-zoekopdracht uit te voeren, kunt u uw query-sequenties in de sequentie-editor typen.

Als uw querysequentie een eenvoudige nucleotidevolgorde zonder structuur is, wordt een gangbaar blast n-algoritme gebruikt voor sequenties inclusief hun secundaire structuren. De webinterface maakt gebruik van het I Ts two blast-algoritme. Start het proces door op blast te klikken.

Na enkele ogenblikken worden uw blast-hits weergegeven in een nieuw tabblad. Hier ziet u voor elke query-sequentie één tabblad. Door op 'toon alignments' te klikken, kunt u door de blast-alignments scrollen. Zoals eerder beschreven kunt u de sequentiestructuurparen naar keuze selecteren en toevoegen aan de datapool.

Tijdens uw werk met de ITS-twee-database kan uw datapool gevuld zijn geraakt met verschillende sequentiestructuren. U kunt op elk gewenst moment toegang krijgen tot uw datapool en de inhoud ervan bekijken. De volgende stap van uw analyse is de multiple sequence alignment van de structuren.

Klik op analyze dataset, en vervolgens op sequence and structure om de sequence structure alignment uit te voeren. U wordt nu gevraagd de grafische weergavemodus van uw alignment te selecteren. Voor een grote set sequenties wordt aanbevolen om de slim-versie te kiezen.

Aangezien onze datapool slechts enkele sequentiestructuren bevat, kiezen we voor de volledige grafische modus. Nadat de berekening is voltooid, wordt de alignment aan uw datapool toegevoegd. Door één kant van een basenpaar te markeren, wordt de tegenhanger automatisch ook gemarkeerd.

Ten slotte kan de alignment worden opgeslagen door op safe alignment te klikken. Zodra u tevreden bent over de kwaliteit van de alignment van uw sequentiestructuur, kunt u een fylogenetische neighbor-joining tree berekenen door op analyze data set te klikken en vervolgens op neighbor. De resulterende joining tree verschijnt in een nieuw tabblad.

U kunt uw boom vrij schalen met behulp van de schuifbalk en uw boom opnieuw routeren door op een willekeurige knoop of blad van de boom te klikken en vervolgens bij deze knoop te herrouteren. Als u een taxon uit uw datapool wilt verwijderen, klikt u op het blad en kiest u voor 'Verwijder deze knoop uit pool'.

Nu kunt u uw alignering en stamboom opnieuw berekenen met een gereduceerde taxonsteekproef door op 'save tree' te klikken. U kunt uw fylogenetische stamboom opslaan in het NU-formaat. Klik op 'about this website' en vervolgens op 'tools' voor aanvullende informatie over de te koop aangeboden standalone-tools en pro s.

Naast de uitlijning met de Neighbor joining-functie, zoals ook aangeboden via de webinterface van de ITS2-database, heeft u nu toegang tot verschillende nieuwe functies, bijvoorbeeld soortdelimitatie op basis van compensatoire veranderingen. In de afgelopen minuten wilden we u enkele tips laten zien om uw fylogenetische analyse te verbeteren. We hebben gedemonstreerd hoe u uw gegevens uit de ITS2-database verzamelt, deze uitlijnt met MAFFT en tenslotte uw bomen berekent met Pro S. In al deze stappen hebben we niet alleen rekening gehouden met de sequentie, maar met zowel de sequentie als de structuur. Zeker.

We hopen dat u heeft genoten van ons korte filmpje en het uitgebreide bouwen van de boom. Welterusten.