Fenotypische en functionele karakterisering van endotheliale Colony Forming Cellen uit menselijk navelstrengbloed

Het algemene doel van deze procedure is om uit te leggen hoe endotheliale kolonievormende cellen of e CFC's kunnen worden afgeleid uit humaan navelstrengbloed. Dit wordt bereikt door eerst mononucleaire cellen uit het navelstrengbloed uit te platen, om vervolgens kolonie-uitgroei van E CFC's te klonen en te expanderen. De tweede stap is om de cellen in vitro te karakteriseren met behulp van een nieuwe single-cell assay-techniek voor klonaal proliferatief potentieel.

Ten slotte worden de cellen gekarakteriseerd in een in vivo vaatvormende assay door de productie en implantatie van gels met ECFC's in nud/nud-muizen. Uiteindelijk kan de in vivo vorming van de novo met bloed gevulde gastvaten worden geëvalueerd door middel van H&E-kleuring van de cellulaire implantaten die ECFC's bevatten. Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden is dat zij de bestudering van het proliferatievermogen van endotheelcellen op enkelcelniveau mogelijk maken.

De implicaties van deze techniek kunnen worden uitgebreid naar het vinden van diagnostische en therapeutische instrumenten voor ziekten zoals perifeer arterieel vaatlijden of PAD, omdat deze techniek ons in staat stelt om het proliferatieve potentieel en het genetische vermogen van de endotheelcellen van een patiënt te onderzoeken. Voeg vóór aanvang van de procedure één milliliter rattenstaartcollageen type 1 toe aan elke put van een weefselkweekplaat met zes putten en laat de plaat vervolgens een nacht incuberen. Verdeel op de dag van de procedure het navelstrengbloed in aliquoten van 15 milliliter in conische centrifugebuizen van 50 milliliter. Voeg vervolgens 20 milliliter PBS toe aan elke buis en pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer.

Trek vervolgens 15 milliliter Ficoll-PA op in een pipet, plaats de punt van de pipet op de bodem van de buis met verdund bloed en voeg voorzichtig de Ficoll toe. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 740 ×g bij kamertemperatuur, zonder de vertragingsrem ingesteld. Verwijder na de celscheiding met een transferpipet de troebele laag met mononucleaire cellen met lage dichtheid, die zich bevindt op de interface tussen de Ficoll-piek en het verdunde plasma. Breng de verzamelde cellen over naar een conische buis van 50 milliliter met 10 milliliter EGM-2 medium en pellet de mononucleaire cellen gedurende 10 minuten bij 515 ×g bij kamertemperatuur met de hoge vertragingsrem ingesteld; aspireer vervolgens voorzichtig het supernatant en gooi dit weg.

Was vervolgens de gepelletteerde cellen twee keer met EGM twee en resuspendeer de mononucleaire cellen in EGM twee op een concentratie van 1,25 × 10⁷ cellen per milliliter. Pipetteer nu vier milliliter van de mononucleaire celsuspensie in elke well van de collageen-gecoate plaat en incubeer de cellen tot er op de eerste dag kolonies worden gevormd. Verwijder na incubatie langzaam het gebruikte medium uit de wells met een pipette zonder de losjes hechtende cellen te verstoren.

Voeg vervolgens voorzichtig vier milliliters E GM two toe aan de wells en plaats de plaat terug in de incubator. Kolonies verschijnen gewoonlijk tussen dag vijf en 14, de dag vóór de procedure. Bij 50 microliters rattenstaartcollageen.

Voeg, zoals voorheen, één van elk toe aan elke well van een 96-wells plaat en incubeer de plaat overnacht op de dag van de procedure. Begin met het tweemaal wassen met PBS van cellen die slechts twee tot drie keer zijn gepassaged. Plaats na het aspireren van de laatste PBS-was een steriele, met gel gecoate klooncilinder rond elke kolonie, waarbij elke cilinder met een steriele pincet stevig tegen de plaat wordt gedrukt.

Voeg twee tot drie druppels warme triple E express toe aan elke klooncilinder en incubeer de cilinders gedurende drie tot vijf minuten totdat de cellen beginnen los te laten. Zodra de cellen zijn begonnen los te laten, voegt u ongeveer 250 µL EGM two-medium toe in het midden van de cilinder en pipetteert u dit op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te genereren. Draag nu de suspensie van enkelvoudige cellen uit elke klooncilinder afzonderlijk over naar een individuele microcentrifugebuis.

Infecteer de cellen in een plaat met zes putjes met EGFP-expresserende lentivirussen en verzamel de cellen die EGFP tot expressie brengen middels fluorescentie-cytometrie. Incubeer vervolgens de EGFP-positieve cellen en EGM-2 in de met collageen gecoate platen. Wanneer de E-CFC's gereed zijn, verzamel deze met behulp van TrypLE Express zoals zojuist gedemonstreerd en resuspendeer de cellen in EGM-2 medium tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10⁶ cellen per milliliter.

Sorteer vervolgens met een flowsorter met een lage stroomsnelheid van 20 cellen per seconde één enkele EGP-positieve ECFC per put in de eerder voorbereide collageen-gecoate 96-wells plaat en vul het uiteindelijke volume van elke put aan met EGM-2 tot ongeveer 200 µL per put. Gebruik daarna een omgekeerde fluorescentiemicroscoop om te controleren of elke put slechts één cel bevat. Incubeer de plaat gedurende een periode van twee weken, met twee mediumverversingen op dag 14 van de cultuur.

Was elke put met 100 µL PBS voordat de cellen worden gefixeerd met 100 µL 4% paraformaldehyd gedurende 30 minuten. Voor CFC's die geen EGFP tot expressie brengen, wordt na fixatie met paraformaldehyd een cyt-reagens toegevoegd, een groen fluorescerende kernkleurstof, waarna incubatie gedurende één nacht bij vier °C volgt. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om het aantal uitgebreide endotheelcellen visueel te kwantificeren zoals hier gedemonstreerd; putten met een aantal endotheelcellen van 2 tot 50 worden beschouwd als endotheelcelclusters.

Wells met 51 tot 2000 cellen zijn e CFC's met een laag proliferatievermogen en wells met 2001 of meer worden beschouwd als e CFC's met een hoog proliferatievermogen. Nadat de cellen zoals voorheen zijn losgemaakt met triple E express, wordt het aantal levensvatbare cellen van de celcultuur bepaald met een hemocytometer en trypan blue. Breng 2,4 miljoen levensvatbare cellen over naar een conische buis van 50 milliliter en pellet vervolgens de cellen door centrifugatie terwijl de cellen worden neergesponnen.

Meng de componenten voor de gelmatrix grondig en stel vervolgens de pH in op 7,4 met natriumhydroxide terwijl de oplossing op ijs wordt bewaard. Resuspendeer na het verwijderen van het supernatant de pellet in 360 µL warme e GM twee. Voeg vervolgens 840 µL van de gelmatrixoplossing toe aan de cellen en meng de oplossing voorzichtig totdat de cellen volledig in de gel zijn gesuspendeerd. Breng deze ene milliliter cellulair-gel-suspensie over naar één putje van een 12-well weefselkweekplaat en incubeer de plaat totdat de gel polymeriseert.

Dek de gel vervolgens vóór de incubatie gedurende de nacht voorzichtig af met twee milliliter warme EGM two; doe dit de volgende dag vlak voor de implantatie. Gebruik irisscharen om de gel in twee gelijke stukken te snijden en plaats de gelstukken terug in dezelfde kweekput met EGM two-medium. Bevestig de sedatie door middel van een knijptest bij de teen en scheer vervolgens de onderbuik van een geanestheseerde nudig mouse van vijf tot zes weken oud, en maak de chirurgische plaats grondig schoon met alcohol- en betadine-doekjes.

Gebruik vervolgens steriele, scherpe irisscharen om een incisie van ongeveer vijf millimeter te maken in het onderste kwadrant van de buik, zodat de subcutane ruimte tussen de huid en de buikspier wordt blootgesteld. Disseceer de dermale laag met botte dissectie van de buikspier in twee verschillende gebieden van de buik om pockets van 15 tot 20 millimeter breed te creëren, waarvan één naar het bovenste buikkwadrant leidt en één naar een ander gebied van de buik. Til vervolgens de dermale laag net naast de incisie op.

Plaats één helft van de gel in één abdominale pocket en de andere helft van de gel in de andere abdominale pocket. Sluit na het inbrengen van de gels elke incisie met twee tot drie hechtingen met behulp van 5-0 polypropyleen hechtdraad op een snijdende naald. Label de kooikaarten en voer postoperatieve monitoring en analgesie uit volgens de institutionele en protocollaire vereisten.

Na het opofferen van het dier op dag 14 na implantatie, wordt de buik van de muis gereinigd met alcoholpads en wordt de huid ingesneden langs de oorspronkelijke incisielijn. Verwijder vervolgens huidflappen op de waarschijnlijke locatie van de gels. Maak circumferentiële incisies rondom de gels om elk implantaat te verwijderen en plaats de uitgenomen implantaten vervolgens in het zinkfixatiemiddel.

Met deze ECFC-afleidingsmethode hebben we de uitgroei van primaire kolonievorming al vanaf dag vijf waargenomen. Let op de kasseistenenmorfologie van deze ECFC-culturen op dag vijf, zoals aangegeven door de pijlpuntjes. Uitgebreide koloniën brengen endotheliale antigenen tot expressie, maar geen hematopoëtische antigenen.

Zoals getoond in deze representatieve in vitro fenotypische beoordeling van endotheliale en hematopoëtische cellen, heeft immunofenotypering uitgewezen dat e CFCs endotheliale antigenen tot expressie brengen zoals CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four en NRP two, maar geen hematopoëtische antigenen tot expressie brachten, zoals CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four of CD 1 33. Belangrijk is dat, zoals weergegeven in deze staafgrafiek, uitgebreide koloniën een volledige hiërarchie van klonaal proliferatiepotentieel op enkelcelniveau vertonen, variërend van clusters van twee tot 50 cellen tot koloniën van meer dan 2001. Deze micrografieën van koloniën, gekleurd met cyt, een groen fluorescent kernkleurmiddel, zijn verkregen nadat uit navelstrengbloed afgeleide E CFCs gedurende 14 dagen op enkelcelniveau zijn gekweekt.

Bovendien vormen ECFC's gehumaniseerde bloedvaten die worden geperfuseerd met rode bloedcellen van de gastheer wanneer ze worden geïmplanteerd in immuundeficiënte muizen. In deze H&E-kleuring van CELLULARIZE-gelimplantaten die ECFC's uit navelstrengbloed bevatten, kunnen microvaten worden waargenomen die gevuld zijn met rode bloedcellen van de gastheer en die zich na 14 dagen implantatie in de collageen-fibronectinegel hebben gevormd. Hier bevestigt de bruine anti-humane CD 31-kleuring verder de humane oorsprong van deze vaten.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ECFC's afleidt uit menselijk navelstrengbloed, en hoe u ECFC-kolonies na hun ontwikkeling kloont, expandeert en hun functionaliteit karakteriseert. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers naar het vasculaire endotheel om het endotheliale clonale proliferatiepotentieel en het genetische vermogen van endotheliale cellen uit meerdere bronnen te onderzoeken.