Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Het algemene doel van deze procedure is het ontdekken van nieuwe extracellulaire proteïne-interacties die betrokken zijn bij cellulaire herkenningsprocessen, in het bijzonder membraangebonden receptorproteïnen. De AveXis-benadering is ontworpen om de zeer zwakke interactieaffiniteiten die kenmerkend zijn voor deze klasse van proteïne-interacties en het feit dat membraanproteïnen biochemisch moeilijk te manipuleren zijn, te omzeilen. Dit wordt bereikt door eerst een recombinante proteïnebibliotheek samen te stellen van de extracellulaire regio's van celoppervlakreceptoren.

Dit wordt bereikt door expressieplasmiden te ontwerpen die de ectodomeingebieden van de receptoren produceren als oplosbare fragmenten, zowel als monomerische gebiotinyleerde baits als pentamere enzym-getagde prey. De tweede stap is het tot expressie brengen en normaliseren van de eiwitten om ze klaar te maken voor interactiescreening. Alle eiwitten worden geproduceerd in zoogdiercellen om ervoor te zorgen dat post-translationele modificaties, zoals disulfidebruggen en glycosylering, worden toegevoegd.

Een cruciale stap in het protocol is om ervoor te zorgen dat de bait- en prey-eiwitten binnen de bibliotheek allemaal zijn genormaliseerd tot binnen de drempelwaarden. Daarna volgt het spannende gedeelte: het screenen op nieuwe interacties. De baits worden verdeeld over individuele putjes van een microtiterplaat en vervolgens onderzocht op interacties met behulp van de prey.

Vervolgens wordt een wasstap uitgevoerd. De laatste stap is het toevoegen van het substraat voor het enzym om eventueel gevangen prey op de arrays van bait-eiwitten te detecteren. Uiteindelijk kunnen de resultaten van een VEX-screening aantonen welke celoppervlaktereceptoren in staat zijn om bindingspartners te vormen en dus betrokken kunnen zijn bij de herkennings- en communicatieprocessen tussen cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van populaire eiwitextractiemethoden, zoals de gist-twee-hybride methode of biochemische zuiveringen, is dat deze specifiek is ontworpen voor het detecteren van extracellulaire eiwit-eiwitinteracties. De methode is bijzonder geschikt voor het ontdekken van nieuwe interacties tussen membraangebonden receptorproteïnen. Deze interacties zijn moeilijk te detecteren met andere technieken, omdat membraaneiwitten biochemisch lastig te manipuleren zijn en hun interacties met tegenoverliggende receptoren doorgaans extreem zwak zijn.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over hoe cellen elkaar herkennen en met elkaar communiceren. Op moleculair niveau kan deze worden gebruikt om vragen te beantwoorden over fundamentele biologische processen, zoals welke receptorproteïnen op het oppervlak van eicellen en spermacellen met elkaar combineren, of welke receptor-ligandinteracties verantwoordelijk zijn voor cellulaire gedragingen zoals myocytenfusie of de vorming van de neurale lijst. De grootste uitdaging bij deze aanpak is het samenstellen van de bait-and-pray proteïnebibliotheken waarin gescreend wordt op interacties.

Het is ook zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat de bait- en prey-eiwitten genormaliseerd zijn binnen de drempelwaarden die vereist zijn voor de assay. Dit vermindert de frequentie van fout-negatieven en fout-positieven. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode tijdens mijn promotieonderzoek, toen ik probeerde een bindingspartner te identificeren voor het celoppervlakte-eiwit CD 200.

In essentie stelde ik de vraag: wat is het bindingspatroon voor deze specifieke celoppervlaktereceptor? Zelfs vandaag de dag blijft dit een technisch moeilijke vraag om te beantwoorden. Destijds was het menselijk genoom echter bijna voltooid en ik realiseerde me dat we, omdat we nu een volledige lijst hadden van alle celoppervlaktereceptoren in het genoom, in plaats daarvan konden vragen welke receptoreiwitten binnen deze set technisch gezien met elkaar kunnen interageren.

Dit is een veel makkelijker vraagstuk om te beantwoorden, en AveXis was de methode die we hebben ontwikkeld om dit te doen. Zodra een bibliotheek van bait- en prey-expressievectoren is vastgesteld, bereidt u de transfectie daarvan in HEC 2 9 3 E-cellen voor. Begin met het uitplaten van de cellen op de dag vóór de transfectie bij een dichtheid van 250, 000 cellen per milliliter in 50 milliliters Freestyle 2 9 3-medium om een efficiënte biotinylering te waarborgen. Vul het medium dat wordt gebruikt voor de productie van bait-eiwitten, maar niet voor prey-eiwitten, aan met d-biotine. Wanneer alle platen zijn voorbereid, worden de cellen overnacht geïncubeerd onder standaardcondities.

Omdat biotine een lage oplosbaarheid heeft en een nauwkeurige oplossing vereist, geven wij de voorkeur aan het afwegen van de extra biotine, waarna deze aan het medium wordt toegevoegd en de volgende dag krachtig wordt geschud. Transfecteer 50 milliliter gecultiveerde cellen met 25 microgram van het bait- of prey-plasmide met behulp van een geschikt transfectiereagens om gebiotinyleerde baits te produceren; cotransfecteer het bait-construct in een verhouding van 10 op 1 met plasmiden die coderen voor een gesecreteerde vorm van het ELI-eiwit biotineligase per oogst.

Oogst de culturen vijf dagen na transfectie door eerst de cellen te pelletteren middels centrifugatie bij 3000 ×g gedurende 20 minuten en vervolgens het supernatant te filteren door een 0,22 µm filter. Een van de belangrijkste kenmerken van AveXis is dat recombinante eiwitten worden uitgescheiden, waardoor ze kunnen worden verdund of geconcentreerd tot binnen de drempelwaarden voor activiteit. We stelden vast dat recombinante eiwitten een variabele expressie vertonen tot vier grootteordes, waardoor de normalisatiestap het voorkomen van fout-positieven tijdens de screeningsstappen vermindert.

Om te beginnen met de normalisatie van het lokaas, moet niet-geconjugeerd biotinyl-vrij medium via dialyse worden verwijderd, aangezien dit zal concurreren met het gebiotinyleerde lokaaseiwit voor binding aan de streptavidine-bindingsplaatsen; begin hiermee door het lokaas in een dialysebuis te plaatsen. Om een effectieve dialyse van de recombinante eiwitten te garanderen, hebben we vastgesteld dat het belangrijk is om een overschot aan oppervlakte van de dialysebuis te voorzien. Doorgaans gebruiken we twee tot drie keer zoveel buis als feitelijk nodig is voor het volume dat wordt gedialyseerd.

Dialyse het lokaas gedurende een periode van 24 uur uitgebreid tegen een geschikte buffer, zoals PBS, nadat de dialyse is uitgevoerd. Begin een ELISA door de wells van een met streptavidine gecoate microtiterplaat 15 minuten te blokkeren met PBST dat BSA bevat. Maak ondertussen op een schone plaat een reeks van vier 1:3 verdunningen van de lokaaseiwitten in PBST met 2% BSA.

Breng na de incubatie van 15 minuten de verdunning over naar de strep TTR-gecodeerde plaat en incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was na een uur de wells en voeg vervolgens aan elke well 100 µL OX 68 van 2 µg/mL toe. Incubeer de plaat nogmaals een uur bij kamertemperatuur. Voer na de tweede incubatie opnieuw een wasserie uit en belaad de plaat met anti-US alkalische fosfatase.

Incubeer de plaat nog een derde uur bij kamertemperatuur. Was de plaat nu drie keer met PBST en volg dit met een laatste wasbeurt met PBS. Om eventuele detergentresten te verwijderen, voegt u na een uur 100 µL van 1 mg/mL substraat 1 0 4 in diethanolaminebuffer toe.

Meet bij kamertemperatuur de absorptie bij 405 nanometer. Een verdunningsreeks van vier verschillende gedialyseerde bait-supernatanten werd gedetecteerd via ELISA met gebruik van een anti-CD4-tag monoklonaal antilichaam. Indien de onverdunde expressie-baitproteïnen onvoldoende zijn om alle biotine-bindingsplaatsen van een streptavidine-gecoate plaat te verzadigen, concentreer de proteïnen dan met een Viva spin concentrator. Gebruik anders het baitproteïne in een verdunde concentratie in PBST met 2%BSA.

Dat is precies voldoende om de biotinebindingsplaats van de assay te verzadigen. Kwantificeer de relatieve niveaus waarop de pre-proteïnen tot expressie komen met behulp van de bèta-lactamase-enzymactiviteit. Begin met het maken van een verdunningsreeks van het supernatant dat de paraproteïnen bevat in PBST 2%BSA-buffer.

Voeg vervolgens 20 µL van de verdunning toe aan 60 µL van een nitrose stepin-oplossing in een plaat. Plaats de plaat onmiddellijk in een platenlezer en meet de absorptie bij 485 nm elke minuut gedurende de volgende 20 minuten met behulp van centrifugale concentrators of verdunning in PBST met 2% BSA. Stel de uiteindelijke concentratie van de monsters zo in dat alle nitros in de assay in ongeveer zeven minuten worden gehydrolyseerd, wat neerkomt op ongeveer twee ol nitros turnover per minuut.

Begin de AveXis-screening door een strep TAVR ENC-gecoate plaat te wassen in PBST en de plaat droog te kloppen tegen een papieren handdoek. Voeg vervolgens PBST met BSA toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende 30 minuten. Dit blokkeert ongewenste eiwitbindingsplaatsen.

Verwijder uit elke put de blokkeeroplossing door de plaat met een korte, krachtige beweging boven een gootsteen leeg te schudden en voeg 100 µL genormaliseerde gebiotinyleerde monomere bait toe aan de betreffende putten. Incubeer de plaat een uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de bait-monsters uit de plaat met een soortgelijke beweging en was de plaat drie keer met PBST.

Klop vervolgens droog na de derde wasbeurt. Voeg nu 100 µL van het genormaliseerde pentameer-prey-construct toe aan elke well en incubeer de plaat gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de plaat na een uur nog drie keer met PBST en volg dit met een laatste wasbeurt met uitsluitend PBS.

Voeg ten slotte 60 µL nitrous seven-oplossing toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur, of bij voorkeur gedurende 16 uur bij 4 °C. De volgende dag zullen positieve interacties rood zijn gekleurd. Maak een foto van de plaat voor een visueel verslag en kwantificeer vervolgens de reacties bij een absorbentie van 485 nm met een plaatlezer.

Ongeveer 10 minuten na het begin van de AveXis-screeningreactie waren geel tot rode kleurveranderingen zichtbaar in zowel de antilichaam-gemedieerde prey-capture-controle als in de interactie van de positieve controle. Deze kleurverandering duidt op hydrolyse van het nitrose-substraat. Enkele positieve interacties zijn op deze tijdschaal waarneembaar, maar de meeste verschenen pas na enkele uren.

Doorgaans is een hitrate van ongeveer 0,4 tot 0,6% positieven waargenomen. Zodra de eiwitbibliotheken zijn klaargemaakt, kan het screeningsgedeelte van deze techniek snel worden uitgevoerd. Het is heel goed mogelijk om tot 12 platen per dag te screenen nadat een interactie is geïdentificeerd.

De belangrijkste volgende stap is om eerst aan te tonen dat de interactie herhaald kan worden met behulp van nieuwe, onafhankelijke eiwitpreparaten. Ten tweede bepalen we altijd of de interactie onafhankelijk is van de oriëntatie tussen bait en prey, oftewel: kan de interactie worden gereciprokeerd? Dit houdt in dat de domeinen van de bait-vector in de prey-vector worden gekloond en vice versa.

Interacties die herhaald en beantwoord kunnen worden, worden beschouwd als betrouwbaar en zijn altijd als positief aangetoond. Met behulp van andere technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie, maken we graag gebruik van oppervlakteplasmonresonantie om eventuele interacties die we opnieuw identificeren, aanvullend te valideren. Belangrijk is dat dit aantoont dat de twee gezuiverde componenten direct kunnen interageren en dat dit ook kan worden gebruikt om aan te tonen dat de binding verzadigbaar is en daarom specifiek.