Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten
22 maart 2012
De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.
Deze video beschrijft een procedure voor het volgen van T-celreceptor-signaleringsevenementen met behulp van simultane acquisitie via twee kanalen. Total internal reflection fluorescence microscopy of TIRF-microscopie. Eerst worden T-cellen getransfecteerd met een plasmide dat GFP-getagd ZAP 70 codeert. Er wordt een op glas ondersteunde lipide dubbellaag voorbereid, waarin lipide-verankerde peptide-MHC-complexen, adhesiemoleculen en co-stimulerende moleculen zijn opgenomen.
De ZAP 70-getransfecteerde T-cellen worden aan de dubbellaag toegevoegd wanneer de T-celreceptoren worden gebonden door peptide-MHC-complexen. De met de T-celreceptor geassocieerde CD3-ketens worden gefosforyleerd door de SARC-familiekinase LCK, waarna de kinase zap 70 vanuit het cytoplasma wordt gerekruteerd. De T-celreceptor wordt vervolgens fluorescent gelabeld en er wordt beeldvorming uitgevoerd waarbij de cellen zijn ondergedompeld in een medium met een lagere brekingsindex dan het dekglas en worden belicht door een laserstraal onder een hoek die totale interne reflectie ondergaat.
Dit genereert een evanescente golf op de grensvlak tussen glas en water, die exponentieel afneemt in het medium, waardoor een penetratiediepte van 100 tot 200 nanometer mogelijk is. Hierdoor worden alleen fluoroforen in het plasmamembraan of zeer dicht daarbij geëxciteerd. Analyse van de resulterende beelden onthult dat signalering plaatsvindt in microclusters van de T-celreceptor.
Het belangrijkste voordeel van TIRF-microscopie of conventionele confocale microscopie is dat men een betere resolutie verkrijgt, waardoor signaleringsclusters of signaleringscomplexen, zoals TCR-microclusters, gemakkelijk gevisualiseerd kunnen worden. Travis Crites en Chen, beide postdocs in mijn lab, zullen demonstreren hoe primaire muis-T-cellen getransfecteerd kunnen worden met behulp van de maxi nucleofection-technologie en vervolgens hoe deze afgebeeld kunnen worden met total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M), gestimuleerd door een glazen ondersteunde lipide bilaag die antigeen bevat.
Deze methode is uitgebreid gebruikt om signalering in diverse immuuncellen te bestuderen, waaronder T-cellen, B-cellen, natural killer-cellen en mestcellen. De methode is breed toepasbaar en kan worden gebruikt om de meeste receptorgstystemen in zoogdiercellen te bestuderen, vooral wanneer signalering in clusters plaatsvindt. Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen in het begin moeite hebben, aangezien T-cellen zeer moeilijk te transfecteren zijn.
Daarnaast is een nauwkeurige coördinatie vereist zodat de levensvatbaarheid van de T-cellen en de transfectie-efficiëntie, de bilar-kwaliteit en de uitlijning van de microscoop aan de eisen voldoen. De eerste stap van deze procedure is het transfecteren van ofwel naïeve of in vitro geactiveerde primaire T-cellen met expressieplasmiden en coderende signaalmoleculen getagd met GFP, met behulp van een AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Alle T-cellen die in deze studie zijn gebruikt, drukten de A-N-D-T-C-R uit die het MCC-peptide herkent, aangetroffen op het MHC-molecuul IE van K. De hier getoonde transfectieprocedure wordt uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
Er worden echter enkele tips gegeven om de levensvatbaarheid van de T-cellen na transfectie te bevorderen. Zowel de levensvatbaarheid als de transfectie-efficiëntie zijn hoger in in vitro geactiveerde T-cellen dan in naïeve cellen; daarom maakt dit protocol gebruik van in vitro geactiveerde T-cellen bij aanvang. Bereid voor elke transfectie twee milliliter aangevuld T-celmedium voor door 1,9 milliliter van het in de kit meegeleverde medium, 20 µL component A, 20 µL component B en 100 µL foetaal runderserum te combineren in een buisje van twee milliliter.
Breng twee milliliters medium over naar elke well van een 12-well plaat. Plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende ten minste een uur om het medium te laten equilibreren; resuspensie van getransfecteerde cellen in medium dat koud is of geen pH van 7,2 heeft, zal leiden tot celdood. Combineer voor het bereiden van het transfectiemengsel 82 microliters muizen T-cel nucleo effector-oplossing met 18 microliters supplement twee en vijf micrograms endotoxine-vrij plasmid DNA bij een concentratie van niet minder dan 0,5 micrograms per microliter en meng dit grondig door te tikken.
Breng vijf tot 10 miljoen cellen over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 75 ×g op kamertemperatuur. Gebruik een vacuümaspirator om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen om het celpellet in het transfectiemengsel te resuspenderen en aspireer het celpellet voorzichtig en langzaam drie tot vier keer totdat er geen grote celklonters meer aanwezig zijn. Breng de suspensie met een pipet zorgvuldig over naar een gecertificeerde amaxa vete, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
Selecteer het nucleaire effectorprogramma X 0 0 1 op het nucleo-effectorapparaat. Plaats de vete in de Q-vetehouder en druk op de knop om het geselecteerde programma toe te passen. Breng vervolgens de vete en het vooraf geëquilibreerde cultuurmedium direct over naar de zuurkast.
Voeg met de meegeleverde plastic pipet ongeveer 500 microliters van het vooraf geëquilibreerde medium toe aan de vete. Voeg vervolgens de celsuspensie druppel voor druppel toe aan het medium in de plaat.
Incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 °C om een lage expressie van de GFP-getagde eiwitten mogelijk te maken en het ontstaan van artefacten door overexpressie te minimaliseren. In dit onderdeel wordt een methode beschreven voor het uitlijnen van de microscoop voor gelijktijdige beeldvorming via twee kanalen, voordat alle componenten van de microscoop worden ingeschakeld. Start de computer en de software op.
Controleer vervolgens of alle hardwarecomponenten door de software worden herkend. Aangezien de software zonder foutmeldingen start, zijn alle componenten gedetecteerd. Verdun één µL van de subresolutie.
Voeg de fluorescerende multi-fluorescente microsferen toe aan twee milliliters PBS om als colokalisatiestandaard te gebruiken. Voeg vervolgens 0,25 milliliters van de microsfeersuspensie toe aan elke well van een Lab Tech acht-well chambered cover glass-systeem. Plaats het chamber slide-systeem op het platform boven de objectief.
Breng vervolgens de kralenabsorptie op het glas in focus in het live-voorbeeld. Het linkerpaneel is het kanaal waarin GFP-getransfecteerde cellen zichtbaar zullen zijn. Het rechterpaneel toont gelabelde TCR tijdens live-cell imaging-experimenten.
Pas met de Y-uitlijning van de XY, Z-vezelkoppeling de positie van de laserstraal aan, zodat de straal uit het objectief komt en op het plafond wordt geprojecteerd. Het is belangrijk om dit te doen wanneer het objectief zich in de positie bevindt waarin het glasvlak in focus is. Als de straal op het plafond diffuus is, is de straal niet gecollimeerd.
Stel de Z-micrometer in om een volledige collatietest te verkrijgen voor elk van de laserlijnen die in het experiment worden gebruikt. Stel vervolgens met een laservermogensmeter het laservermogen in op 20 tot 30 micro watts voor elk kanaal. T-cellen zijn extreem gevoelig voor laserstraling en de belichting is beperkt tot een gecombineerd totaal van 50 micro watts.
Stel vervolgens de hoek voor de turf in. Draai aan de Y-uitlijningsmicrometer van de vezellaunch om de bundel weg van het plafond te bewegen totdat de hoek ten opzichte van de optische as van de objectieven 90 graden benadert.
Zodra de kritieke hoek voor totale interne reflectie is bereikt, zal het laserlicht het objectief niet meer verlaten. Om te beoordelen of de turf-uitlijning is bereikt, focust u boven en onder het vlak van het dekglas. Merk hierbij op dat wanneer de kralen die aan het oppervlak zijn geadsorbeerd uit focus raken, veel kralen in de oplossing kunnen worden gezien zweven. Om een goede turf-uitlijning te bereiken, is het noodzakelijk om de hoek van de bundel ten opzichte van het objectief te vergroten.
Naarmate de hoek van de bundel wordt vergroot, beginnen de kraaltjes die nabij het oppervlak zweven te verdwijnen en neemt de intensiteit van de kraaltjes die aan de interface zijn geadsorbeerd toe. Wanneer de kraaltjes die aan de interface zijn geadsorbeerd nu uit focus worden gebracht, blijven er geen zwevende kraaltjes in de oplossing zichtbaar. Op dit punt is de opstelling correct uitgelijnd, aangezien alleen de kraaltjes die aan het dekglas zijn geadsorbeerd in focus kunnen zijn.
Richt vervolgens de rode en groene fluorescentiekanalen ten opzichte van elkaar uit door op de beads te focussen en de positie van identificeerbare kenmerken in de beelden van beide kanalen te vergelijken. Gebruik de X- en Y-micrometerschroeven op één camerastatief om de relatieve positie van de beads zo dicht mogelijk bij elkaar te brengen. Let hierbij op de heldere bead in het linkeronderkwadrant van beide beelden om de ruimtelijke uitlijning tussen de twee kanalen te waarborgen.
Deze eigenschap wordt in beide afbeeldingen in dezelfde relatieve positie gebracht. Leg de afbeelding van beide kanalen vast en sla deze op. Deze afbeeldingen zullen worden gebruikt als colocalisatiestandaard om de twee kanalen uit te lijnen.
Een voorbeeld van deze uitlijning is hier te zien vóór de uitlijning. Een van de kanalen is gedraaid ten opzichte van het andere, zoals getoond in deze afbeelding waarin beelden van de subresolutie-beads uit de twee kanalen over elkaar heen zijn gelegd. Na de aanpassingen zijn de beelden uitgelijnd, zoals hier weergegeven.
De kwaliteit van de uitlijning kan verder worden gecontroleerd door beelden van GFP-getransfecteerde levende cellen te vergelijken. Let op hoe het Laila-podium van de twee kanalen perfect zijn uitgelijnd nadat de twee beelden zijn uitgelijnd met behulp van de kalibratie die is vastgesteld met de fluorescerende microbeads.
Zodra de microscoop is ingesteld, worden stroomkamers voorbereid die glasondersteunde lipide dubbellagen bevatten waarin antigenen worden gepresenteerd, en wordt turf M uitgevoerd om eerst TRANSFECTED T-cellen te visualiseren die interageren met het substraat. Volg het door Ana en Dustin beschreven protocol om een stroomkamer te assembleren met planaire lipide dubbellagen gevormd op een glazen dekglas met NI NTA-lipiden, het adhesiemolecuul ICAM 1 en peptide-MHC-complexen. MCC-geladen IEFK worden in de dubbellaag ingebouwd via histidinetags.
Het co-stimulerende molecuul CD 80 wordt geïncorporeerd. Plaats de flowcel met behulp van een GPI-anker op de tafel van de microscoop en stabiliseer deze door de kamer met een spanningsstang aan een adapterplaat op de microscooptafel te bevestigen om deze te immobiliseren. Bevestig vervolgens het door de fabrikant geleverde verwarmingselement aan de flowcel om de temperatuur ervan te regelen.
Plaats het objectief op een dubbellaag en stel het vlak van de dubbellaag scherp om het objectief te kunnen verwarmen; schakel de verwarmingsapparaten van de flowcel en het objectief in om de temperatuur van de kamer naar 37 °C te brengen. Na vier uur incubatie worden de getransecteerde T-cellen overgebracht naar een buis van 15 ml en gecentrifugeerd bij een snelheid van 80 ×g. Resuspendeer de cellen in 300 µL H-B-S-B-S-A-buffer. Voeg vervolgens H 57 FAB of H 57 single-chain variabele fragment toe om de TCR te labelen tot een uiteindelijke concentratie van 10 µg/mL voor FAB of 20 µg/mL voor het single-chain variabele fragment.
Overbreng de cellen naar een fax-buis van vijf milliliter. Injecteer vervolgens de cellen met een slip-tip spuit van één milliliter via een drievatenkraan in de flowkamer. Stel de beeldvormingscondities zo in dat de dual-channel live-acquisitie een live-voorbeeld van de TCR- en GFP-kanalen toont en zoek een veld met getransfecteerde cellen.
Vanwege intensiteitsverschillen tussen de TCR en GFP moet de schaling van de beelden mogelijk in realtime worden aangepast, zodat cellen in beide kanalen kunnen worden gevisualiseerd. Bevestig, zoals hier het geval is, de turf-illuminatie door het glasvlak scherp te stellen om eventuele laterale membraankleuring te detecteren. Als de laterale membranen niet scherp worden gesteld, is de turf-uitlijning correct.
In deze live preview is de laterale membraankleuring zichtbaar, zowel in het vlak van het dekglas als wanneer het dekglas uit focus wordt gebracht om de microscoop in een goede turf-uitlijning te brengen. De hoek van de laser ten opzichte van het objectief wordt vergroot en het laterale membraan raakt uit focus. Begin met het vastleggen van individuele beelden en time-lapse-sequenties met een interval van 10 seconden.
Gedurende vijf minuten werden de cellen geïncubeerd op door glas ondersteunde INTA-bilagen die bestonden uit zes moleculen per vierkante micrometer peptide geladen hist-getagd IEFK, 100 moleculen per vierkante micrometer Alexa 647-geconjugeerde hist-getagde ICAM-1 en 100 moleculen per vierkante micrometer GPI-verankerde CD80. Dual-channel simultane acquisitie TIRF-microscopie werd uitgevoerd in de continue aanwezigheid van Alexa 546-geconjugeerde H57 FAB-fragmenten.
Om de TCR te kleuren, werden de cellen tot één uur na het eerste contact met de dubbellaag afgebeeld. Het aantal ZAP 70-clusters per cel werd geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde software voor het tellen van clusters. In elk geval werden ten minste 40 cellen geanalyseerd.
De geladen peptiden worden aangegeven in het inzetsel. ICAM one verwijst naar cellen op bilaayen die 100 moleculen per vierkante micrometer Alexa 6 4 7 geconjugeerd His-tagged ICAM one bevatten, zoals getoond in de figuur. Zap 70-afhankelijke signalering vindt plaats in TCR-microclusters en uitsluitend als reactie op agonisten-liganden, zoals te zien is in deze video, opgenomen met 10 seconden per frame.
TCR-signalering in reactie op agonistische peptiden wordt in stand gehouden door de continue generatie van TCR-microclusters in de periferie van het contactgebied die ZAP 70 rekruteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe primaire T-cellen getransfecteerd kunnen worden met behulp van maxa nucleaire affectietechnologie en hoe de rekrutering van GFPT-signaleringsmoleculen naar TCR-microclusters correct kan worden afgebeeld met turf-microscopie. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in zeven uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.
Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zeer voorzichtig om te gaan met de primaire cellen. Hoe gezonder de cellen in elke stap van het experiment zijn, hoe hoger de transfectie-efficiëntie zal zijn en hoe meer cellen u zult vastleggen in uw beeldvorming. T-cellen zijn zeer beweeglijk en als gevolg hiervan zorgt sequentiële beeldvorming van het TCR- en GFP-kanaal ervoor dat de twee beelden niet perfect uitlijnen door de beweging van TCR-microclusters en cellen.
Om dit probleem op te lossen, hebben we de dual channel simultaneous acquisition turf microscope ontwikkeld.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het volgen van signaleringsgebeurtenissen van T-celreceptoren met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie. De techniek maakt de visualisatie van signaleringscomplexen in T-cellen mogelijk, wat inzicht biedt in de ruimtelijke en temporele dynamiek van eiwitinteracties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Het begrijpen van proteïnecompartimentalisatie is cruciaal voor het bestuderen van signaleringspaden.
- TIRF-microscopie maakt hoge-resolutie beeldvorming van proteïne-interacties mogelijk.
- Signaleringsgebeurtenissen in T-cellen zijn essentieel voor immuunresponsen.
- Eerdere methoden beschikten niet over de resolutie om microclusters effectief te visualiseren.
Doel van de studie
- Om een op TIRF-microscopie gebaseerd systeem aan te tonen voor het bestuderen van T-celreceptor-signalering.
- Om een protocol te bieden voor het transfecteren van T-cellen met GFP-gelabelde signaleringsmoleculen.
- Om de voordelen van TIRF-microscopie ten opzichte van conventionele methoden te belichten.
Gebruikte methoden
- Transfectie van primaire muis T-cellen met GFP-getagde ZAP-70.
- Preparatie van een op glas ondersteunde lipide dubbellaag met peptide-MHC-complexen.
- Beeldvorming met TIRF-microscopie om microclusters van de T-celreceptor te visualiseren.
- Analyse van signaleringsgebeurtenissen via gelijktijdige acquisitie met twee kanalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van T-celreceptor-microclusters tijdens signalering.
- Demonstratie van verbeterde resolutie in TIRF-microscopie vergeleken met confocale microscopie.
- Identificatie van belangrijke signaleringsgebeurtenissen en proteïne-interacties in T-cellen.
- Protocoltips voor het verbeteren van de levensvatbaarheid van T-cellen en de transfectie-efficiëntie.
Conclusies
- TIRF-microscopie is een krachtig instrument voor het bestuderen van de signaaldynamiek van T-cellen.
- De methode is breed toepasbaar op diverse receptorsystemen in zoogdiercellen.
- Verder onderzoek kan deze techniek benutten om de signalering van immuuncellen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze TIRF-microscopietechniek maakt real-time, simultane beeldvorming van de TCR en geassocieerde signaleringsproteïnen mogelijk, wat een cruciale ruimtelijke en temporele resolutie biedt voor validatie van targets in een vroeg stadium binnen de immunologie. Door de vorming van TCR-microclusters en downstream signaleringsgebeurtenissen, zoals de rekrutering van Zap70, te visualiseren, ondersteunt deze methode het mechanistische de-risking van therapeutische hypothesen met betrekking tot T-cel-activatiepaden. De aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds door directe observatie van proteïne-interacties aan het plasmamembraan onder fysiologisch relevante condities mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van TCR-signaleringshypothesen mogelijk door de real-time rekrutering van signaleringsproteïnen zoals Zap70 naar TCR-microclusters te visualiseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door directe observatie van kinase-activatie en fosforylering van adapterproteïnen in levende T-cellen.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in de targetselectie door ligandbinding te koppelen aan de vorming van downstream signaleringscomplexen via een kwantitatieve, op imaging gebaseerde readout.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten, zoals Zap70-clusteraantallen per cel via geautomatiseerde analyse, wat reproduceerbare screeningscondities mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Gelijktijdige acquisitie via twee kanalen maakt parallelle monitoring van receptorbinding en de rekrutering van signalerende eiwitten mogelijk, wat de doorvoer voor de evaluatie van verbindingen of liganden verhoogt.
- Reproduceerbaarheid: Protocollen voor microscoopuitlijning met behulp van fluorescerende microsfeerstandaarden waarborgen een consistente kanaalregistratie tussen experimenten en gebruikers.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinische validatie door een ziekterelevant systeem te bieden voor het bestuderen van de dynamiek van TCR-signalering onder gedefinieerde stimuleringscondities.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen signalering afhankelijk is van agonist-liganden en specifiek plaatsvindt in TCR-microclusters, waardoor ambiguïteit bij de interpretatie van signaalpaden wordt verminderd.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie van fosforyleringsafhankelijke signaleringsgebeurtenissen die kunnen correleren met functionele T-celresponsen en differentiatieresultaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-engagement tot vroege lead-optimalisatie, in het bijzonder voor immunomodulatoren die de signalering van de T-celreceptor beïnvloeden.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetesten door visualisatie van de ruimtelijke organisatie en temporele dynamiek van TCR-geassocieerde signaleringscomplexen mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve, op beeldvorming gebaseerde read-outs (bijv. Zap70-clustervorming) die vergelijkingen tussen ligand-potenties of genetische perturbaties ondersteunen.
- Analytiek: Biedt gemultiplexte, simultane read-outs van receptorlokalisatie en rekrutering van signaleringsproteïnen, waardoor correlatie tussen binding en activatie mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door de vorming van de immunologische synaps te modelleren op ondersteunde lipide dubbellagen met gedefinieerde antigeenpresentatie.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Aanpasbaar aan diverse receptorsystemen in zoogdiercellen waarbij signalering in clusters plaatsvindt, wat het nut over verschillende projecten heen bevordert.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in TCR-signalering door de rekrutering van Zap70 naar microclusters bij agonistbinding direct te visualiseren.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde transfectieprotocollen, de bereiding van lipide dubbellagen en procedures voor dual-channel uitlijning.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van immunotherapie door vroegtijdig mechanisch inzicht te bieden in target-interactie en signaalinitiatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van TCR-gerichte kandidaten mogelijk op basis van gevalideerde signaleringscompetentie in een fysiologisch gecontextualiseerd systeem.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in transfectie van primaire T-cellen en live-cell imaging onder gecontroleerde omgevingscondities.
- Afhankelijk van een TIRF-compatibele microscopie-opstelling met de mogelijkheid tot simultane dual-channel acquisitie en nauwkeurige laseruitlijning.
- Maakt standaardisatie van de lipide-dubbellaagcompositie en antigeenpresentatie noodzakelijk om consistente TCR-binding over verschillende experimenten te waarborgen.
- Omvat optimalisatie van transfectie-efficiëntie en viabiliteit, met name gezien de gevoeligheid van primaire T-cellen voor manipulatie en artefacten door overexpressie.
- Beperkt door de noodzaak van een voorzichtige behandeling om de celviabiliteit te behouden en door drift veroorzaakte uitlijningsfouten tijdens time-lapse imaging te voorkomen.
