Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Het algemene doel van deze procedure is om een gestandaardiseerde follow-up te bewerkstelligen van het in vivo gedrag van stamcellen die in de muizenhersenen zijn getransplanteerd. Dit wordt bereikt door eerst de uit het beenmerg afgeleide stromale cellen, die EGFP en luciferase co-expresseren, te labelen met fluorescerende micron-formaat ijzeroxidepartikels. De tweede stap is het correct injecteren van de met MPIO gelabelde BMC's in het hersenweefsel van de muis.

Vervolgens worden het overleven en de lokalisatie van de celtransplantaten niet-invasief gevolgd met bioluminescentie-imaging en magnetische resonantie-imaging. De laatste stap is het valideren van de in vivo imaging-resultaten middels postmortale histologische analyse. Deze methoden kunnen inzicht bieden in het gedrag van stamcellen na transplantatie in de muizenhersenen, maar kunnen ook worden toegepast op andere systemen, zoals modelorganismen en ziektestudies.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen voor het hanteren van de dieren moeilijk aan te leren zijn omdat intraveneuze en intracerebrale injecties lastig uit te voeren zijn en bepaalde risico's vormen voor het overleven van het dier. Om met deze procedure te beginnen, voegt u 75 times 10 to the six glaciale blauwe micron-grootte ijzeroxide-deeltjes toe aan een subconfluente groeiende celcultuur. Incubeer deze gedurende nog eens 16 hours om de opname van deeltjes via endocytose mogelijk te maken, en spoel vervolgens de resterende deeltjes weg.

Laat de cellen nog 24 uur groeien om celconfluentie en een homogene distributie van de G-B-M-P-I-O te verkrijgen. Gebruik daarna fluorescentiemicroscopie om de opname van de partikels visueel te valideren door de ratio van EGFP-positieve en G-B-M-P-I-O-positieve cellen ten opzichte van het totale aantal EGFP-positieve cellen te berekenen. Was vervolgens de met G-B-M-P-I-O gelabelde BMSC-luciferase EGFP-cellen twee keer met 10 milliliters.

Behandel de cellen met trypsine-EDTA in PBS en oogst deze vervolgens. Was daarna de cellen en resuspendeer ze in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 133 × 10⁶ cellen per milliliter. Bewaar de cellen tot aan de transplantatie op ijs.

Anestheseer de muis in deze procedure door middel van een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine (80 milligram per kilogram) en xylazine (16 milligram per kilogram). Wacht vijf minuten tot de muis in slaap is gevallen en scheer vervolgens de kop om steriele manipulaties mogelijk te maken. Plaats de muis daarna in een stereotactisch frame en desinfecteer de huid met alcohol.

Smeer daarna zalf in de ogen om uitdroging te voorkomen. Maak een incisie in de middellijn van de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen, zodat de hippocampus gericht kan worden. Boor met een tandheelkundige boor een gat in de schedel op twee millimeter posterieur en twee millimeter lateraal.

Vortex op dit punt de celsuspensie kort en zuig de celsuspensie vervolgens op in de spuit. Breng daarna de spuitnaald naar een diepte van 2,5 millimeter onder de dura en laat de druk gedurende één minuut stabiliseren. Trek de naald na een minuut terug naar een positie van twee millimeter onder de dura.

Inject vervolgens drie µL van de cel-suspensie met een geautomatiseerde micro-injectiepompsnelheid van 0,70 µL per minuut. Wacht na de injectie nog vijf minuten om terugstroom van de geïnjecteerde cel-suspensie te voorkomen. Trek daarna de naald langzaam terug.

Desinfecteer vervolgens de huidranden en hecht daarna de huid. Injecteer subcutaan 300 µL 0,9% natriumchloride-oplossing om dehydratie te voorkomen. Plaats de muis tot slot onder een warmtelamp om het herstel van de anesthesie mogelijk te maken, waarna bioluminescentie-imaging kan worden uitgevoerd.

Anestheseer de muis met een mengsel van 3% isofluraan en zuurstof. Plaats de muis vervolgens in de foton-imager. Verlaag het anesthesieniveau door het isofluraan aan te passen naar 1,5%. Injecteer vervolgens d-luciferine intraveneus in een dosis van 150 mg/kg lichaamsgewicht.

Leg gedurende vijf minuten beelden vast met de photo vision-software. Voer vervolgens beeldverwerking uit met de M three vision-software en kwantificeer het waargenomen signaal met behulp van vaste regions of interest. Om magnetische resonantie-beeldvorming uit te voeren, wordt de muis geanestheseerd met 3% ISO-fluorine in een mengsel van zuurstof en stikstofmonoxide.

Plaats de muis vervolgens in de fixatiehouder van een horizontaal 9,4 Tesla MR-systeem. Verlaag het anesthesieniveau door de isofluoraan aan te passen naar 1%. Breng daarna zalf aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen. Gebruik vervolgens een rectale probe om de lichaamstemperatuur te bewaken.

Plaats vervolgens een sensor onder de buik van de muis om de ademhalingsfrequentie te bewaken. Houd de ademhalingsfrequentie op 110 ± 10 keer per minuut en houd de lichaamstemperatuur constant binnen een nauw bereik van 37 ± 0,5 °C. Plaats daarna de RF-oppervlaktespoel bovenop de kop van de muis.

Plaats de muis in het midden van de magneet. Open vervolgens ParaVision 5.1. Stel de sequentieparameters in volgens het bijbehorende manuscript. Neem daarna een set van 10 coronale T2-gewogen spin-echo beelden op om specifieke anatomische informatie te verkrijgen.

Maak NT two star weighted gradient echo-beelden om de migratie van stamcellen te bestuderen met een vlakke resolutie van 70 micrometers squared. Offer in deze stap de muis op en verwijder de hersenen. Fixeer het hersenweefsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur in 4%paraldehyde in PBS.

Na twee uur. Dehydrateer het hersenweefsel door het in verschillende sucrose-gradiënten bij vier graden Celsius te plaatsen. Vries het hersenweefsel de volgende dag in met vloeibare stikstof en bewaar het weefsel bij minus 80 graden Celsius tot het moment van doorsnijden.

Snijd het hersenweefsel in secties van 10 micrometer dik met behulp van een cryostaat. Screen vervolgens de ongekleurde cryosecties onder een fluorescentiemicroscoop op blauwe fluorescentie van de G-B-M-P-I-O-deeltjes en groene fluorescentie van de EGFP-expresserende cellen. Screen de ongekleurde cryosecties daarna op groen-rode achtergrondfluorescentie van de ontstekingscellen.

De beschreven labelingsprocedure met glacial blue MPIO resulteert in een zeer efficiënte labeling van BMSC-luciferase EGFP-cellen, wat eenvoudig kan worden gevalideerd met fluorescentiemicroscopie. Vervolgens kan, na transplantatie van G-B-M-P-I-O gelabelde BMSC-luciferase EGFP-cellen in het centrale zenuwstelsel van muizen, de overleving van het cellulaire transplantaat worden gemonitord via in vivo bioluminescentie-imaging op basis van luciferase-activiteit. Daarnaast kan de exacte lokalisatie van de getransplanteerde cellen worden gemonitord via in vivo MRI op basis van het ijzergehalte van de glacial blue MPIO.

Ten slotte toont histologische analyse de validatie van de resultaten aan die zijn verkregen via bioluminescentie-beeldvorming en magnetische resonantie-beeldvorming. Stabiele overleving werd bevestigd door een stabiele EGFP-expressie in de tijd na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van moleculaire beeldvorming om cellulaire en moleculaire gebeurtenissen na stamceltransplantatie in verschillende diermodellen voor neurodegeneratieve ziekten te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het uitvoeren van moleculaire beeldvorming, waarbij bioluminescentie en magnetische resonantiebeeldvorming worden toegepast, en het adequaat valideren van in vivo resultaten middels postmortale histologische evaluatie.