Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc

Intracellulair calcium wordt beschouwd als een essentieel onderdeel van verschillende mechanismen van synaptische plasticiteit. Deze ideeën kunnen worden getoetst door gelijktijdig veranderingen in calcium en wijzigingen in de synaptische efficiëntie te monitoren. Hier demonstreer we hoe dit wordt bereikt door calcium-imaging te combineren met intracellulaire registratie.

Onze experimenten worden uitgevoerd met een ganglion van de weekdier Aplysia Cahora. Deze preparatie biedt een aantal voordelen, zoals grote geïdentificeerde neuronen, de voor apia natuurlijke lage temperaturen en trage signalen die beeldvorming vergemakkelijken, maar de algemene technieken die wij demonstreren zijn eenvoudig overdraagbaar naar andere systemen. Hallo, ik ben Colin Evans uit het laboratorium van Elizabeth Cropper in het Fishburg Department of Neuroscience en het Freedman Brain Institute aan de Mount Sinai School of Medicine in New York City.

Vandaag zullen we de gelijktijdige beeldvorming van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en synaptische efficiëntie in het buccale ganglion van de weekdier Aplysia cahora demonstreren. Om intracellulair calcium te detecteren, injecteren we een presynaptisch neuron met de celpermeante calciumindicatorkleurstof calcium orange. De preparatie wordt vervolgens onder de microscoop geplaatst en de pre- en postsynaptische neuronen worden gepenetreerd met scherpe elektroden.

Herhaalde presynaptische stimulatie resulteert in een versterkte postsynaptische respons, zichtbaar als een toenemende postsynaptische potentiaal of PSP-amplitude. Het meten van het fluorescentiesignaal van de calciumindicatorkleurstof stelt ons in staat om gelijktijdige veranderingen in presynaptisch intracellulair calcium te detecteren. Begin met het anesthetiseren van een volwassen dier met een gewicht van ongeveer 150 gram door 75 mils isotonische magnesiumchloride-oplossing te injecteren, spelden het geanestheseerde dier vast op een met was bedekt schaaltje en maak vervolgens met grove pincetten en een schaar een incisie in de voet van het dier om de buccale massa bloot te leggen.

Het buccale ganglion bevindt zich aan de ventrale zijde van de buccale massa en bestaat uit twee verbonden hemi-ganglia. Het bevat enkele honderden neuronen die, samen met neuronen in andere ganglia, bijdragen aan de generatie en controle van het voedingsgedrag van het dier. Bevrij het ganglion zorgvuldig door alle buccale zenuwen met een fijne schaar door te snijden en verwijder het uit het dier.

Zet vervolgens het bevrijde ganglion vast op de bodem van een met sil guard gecoate schaal gevuld met kunstmatig zeewater. Het ganglion is omgeven door een schede van bindweefsel, die verwijderd moet worden om de individuele neuronen bloot te leggen. Gebruik pincetten, irisscharen en uiterste zorg om deze schede weg te snijden.

Om beschadiging van neuronen te voorkomen, moet het ganglion met een schede worden gestabiliseerd met pinnen gedurende ongeveer 15 minuten, aangezien elke beweging problematisch zal zijn tijdens de beeldvorming. Om scherpe elektroden voor intracellulaire registratie en kleurstofinjectie te prepareren, wordt capillaire buis getrokken met een micro-elektrodenpuller. Wij gebruiken dunwandig filament borosilicaatglas met een buitendiameter van 1 millimeter.

De registratie-elektroden moeten een weerstand van ongeveer 10 MΩ hebben wanneer ze zijn gevuld met drie molar kaliumacetaat, dus we stellen de puller dienovereenkomstig in om de D-elektroden te vullen. Dompel de achterzijde van de getrokken elektrode in een 10 millimolaire oplossing van de calcium-oranje kleurstof; capillaire werking langs de glazen filament binnenin de elektrode zal de kleurstof naar de punt trekken, waarna de elektrode wordt teruggevuld met 200 millimolaire kaliumchloride om een goed elektrisch contact te garanderen. We gebruiken een op maat gebouwde bleacher om de eigenschappen van de elektrode te verbeteren en de weerstand van de registratie-elektrode te verlagen tot ongeveer 5 MΩ.

De elektrode wordt onder een hoek van 45 graden in een stroom van een aluminiumoxidesuspensie gehouden. Door natriumchloride aan de suspensie toe te voegen en een ohmmeter aan te sluiten, kan de weerstand van de elektrode worden gemonitord. Tijdens het afschuiningsproces brengen we de schaal met de gedissecteerde buckle-ganglia over naar een elektrofysiologische opstelling en lokaliseren we de neuronen van belang door ze met elektroden te doorboren en hun identiteit te verifiëren.

Om neuronen voorbij calcium-imaging voor te bereiden, plaatsen we eerst een met kleurstof gevulde elektrode in het soma van de cel en laden we de kleurstof elektroforetisch met 30 minuten hyperpolariserende stroompulsen van 15 nano amp. Terwijl de D calcium orange de cel binnendringt, krijgt het SOR een lichtroze kleur. Vervolgens trekken we de registratie-elektroden voorzichtig terug en laten we het preparaat ten minste 30 minuten rusten, zodat de kleurstof kan diffunderen naar de fijne uitlopers van het neuron.

Breng vervolgens de schaal met de preparatie over naar een fluorescentiemicroscoop. Wij maken gebruik van een 10x NA 0,3 waterimmersie-objectief op een rechtopstaande microscoop met een vaste tafel, waarbij de focus wordt ingesteld door het objectief te bewegen en niet de tafel. Dit vergemakkelijkt de montage van manipulatoren.

Selecteer een geschikt filterblok voor de registratie-elektroden. Een SI three filterblok biedt de juiste excitatie- en emissiefilters voor calcium orange; stel de cameraparameters en de verlichtingsintensiteit in met neutrale dichtheidsfilters en de veldapertuur. Meer licht resulteert in minder ruis, maar kan potentieel leiden tot bleking van het preparaat.

De cool snap CCD-camera kan een veld van 500 bij 300 pixels vastleggen met een framerate van ongeveer 30 frames per seconde en een goede signaal-ruisverhouding. Minimaliseer de belichting van de fil-neuronen door de sluiter van de lichtbronnen zoveel mogelijk gesloten te houden. Selecteer in de imaging-software de regio's van interesse of ROI's.

Deze regio's bepalen waar de software intensiteitsmetingen zal uitvoeren. Over het algemeen brengen we de primaire, secundaire en tertiaire vertakkingen van het presynaptische neuron in beeld. Plaats een extra ROI naast het difi-neuron om een achtergrondwaarde te verkrijgen, die later van alle andere datapunten wordt afgetrokken.

Intracellulaire registratie-elektroden in de pre- en postsynaptische neuronen worden gebruikt om synaptische transmissie te induceren en te monitoren. U kunt synchronisatie tussen de elektrofysiologische gegevensverzameling en de beeldvorming waarborgen door het frame-out triggersignaal van de camera te gebruiken om de software voor gegevensverzameling te starten. Een andere manier om synchronisatie te waarborgen is door een LED in de camerapoort te monteren.

Deze LED wordt aan het begin van de opnamesessie kort ingeschakeld en dient hiermee als synchronisatiepunt. Tijdens een typisch experiment trigger je actiepotentialen in het presynaptische neuron door middel van korte stroompulsen. In dit voorbeeld tonen we een burst van spikes en de corresponderende toenames in het calciumsignaal om specifieke hypothesen te testen.

Het calciumsignaal kan worden gemanipuleerd om de effecten op de synaptische transmissie te bepalen. Zo kunnen geneesmiddelen, zoals de calciumchelator EGTA, presynaptisch worden geïnjecteerd of via het perfusiesysteem worden toegediend. Gegevens worden geanalyseerd door deze uit de imaging-software naar een tekstbestand te exporteren en vervolgens naar de software waarin de elektrofysiologische gegevens zijn verzameld, wat in ons geval spike2 van Cambridge Electronic Design is.

We gebruiken een op maat geschreven script om de intensiteitswaarden van de ROI en de overeenkomstige veranderingen in het membraanpotentiaal uit te zetten en veranderingen in het calciumsignaal te kwantificeren door het achtergrondsignaal, verkregen uit de achtergrond-ROI, af te trekken en de relatieve verandering te berekenen met de getoonde vergelijking. F nul is de fluorescentie vlak voor stimulatie, en F is de fluorescentie tijdens stimulatie. Hier tonen we de resultaten van een experiment waarin we veranderingen in calciumfluorescentie in het geïdentificeerde neuron B 21 in beeld hebben gebracht.

De regio die we hebben afgebeeld is aangegeven in A; in B1 hebben we een burst van spikes geïnduceerd in B21, wat postsynaptische potentialen in B8 en een verandering in het calciumsignaal veroorzaakte. B2 toont het effect van de injectie van de calciumchelator EGTA; spikes in B21 induceren geen wijdverspreide toenames in calciumfluorescentie meer en de amplitude van het postsynaptische potentiaal is afgenomen.

Concluderend hebben we technieken gedemonstreerd die kunnen worden gebruikt om gelijktijdig de intracellulaire calciumconcentratie te monitoren en de effectiviteit van de synaptische transmissie te evalueren. Deze technieken vereisen slechts bescheiden apparatuur in vergelijking met de meeste functionele beeldvorming en zijn eenvoudig en snel te leren.