Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van DNA-methylatie en veranderingen in genexpressie na stress op vroege leeftijd. Dit wordt bereikt door pasgeboren muizenpups eerst bloot te stellen aan moederlijke scheiding om stress op vroege leeftijd op te wekken, waarna in een tweede stap de relevante hersengebieden, in dit geval de PVN, worden verkregen door microdissectie in loco en DNA en RNA gelijktijdig worden geïsoleerd uit één enkel weefselstempel.

Vervolgens wordt het verkregen DNA behandeld met sulfiet en wordt het gebied van belang geamplificeerd via bisulfiet-PCR. Dit wordt daarna geligeerd in een vector en getransformeerd in bacteriën. Succesvolle transformaties worden geïdentificeerd aan de hand van marker-expressie en de grootte van het PCR-fragment.

En ten slotte wordt bisulfietsequencing gebruikt om de methyleringsstatus te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat het een handige analyse mogelijk maakt van epigenetische programmering als reactie op omgevingsprikkels. Deze methode kan inzicht bieden in epigenetische programmering door tegenspoed in de vroege levensfase.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen. Overal waar methylering en genexpressie worden geanalyseerd in een zeer weefselspecifieke omgeving en waar de beschikbaarheid van weefsel beperkt is. Om vroege levensstress op te wekken, wordt moederlijke scheiding uitgevoerd bij pups van gedateerde drachtige C 57 black six N moederdieren om moederlijke scheiding te bewerkstelligen.

Verplaats elk nest gedurende drie uur per dag van postnatale dag 1 tot 10 naar een verwarmde, schone kooi; laat de ongestreste controlepups ongestoord. Afgezien van de scheiding van drie uur blijven alle nesten bij hun moeders tot het spenen op postnatale dag 21. Vervolgens worden de pups gehuisvest in groepen van hetzelfde geslacht, drie tot vijf muizen per kooi onder standaard huisvestingscondities. Om de verzameling van hersenweefsel te starten, worden de muizenhersenen uit de schedels verwijderd, onmiddellijk ingevroren in isop droogijs en bewaard bij -80 °C.

Wanneer u klaar bent om de weefselponsen te verzamelen, haalt u de hersenen uit de vriezer van -80 °C en plaatst u deze op droogijs. Begin met het cryosectioneren van de hersenen in coronale secties van 10 micron, van rostraal naar caudaal. Monteer de secties op super frost glasplaatjes en laat ze drogen voor kleuring met kristalviolet.

Extra coupes kunnen worden gemaakt en bewaard bij -20 °C voor verdere analyses, zoals in situ hybridisatie. Wanneer de coupes klaar zijn voor het nemen van stansen, kleur de coupes dan met kristalviolet om de relevante hersenstructuren te identificeren. Neem vervolgens met een ponsnaald stansen van 0,8 mm uit de regio's van belang middels in loco microdissectie.

De biopten moeten worden bewaard bij minus 80 °C. Het is van cruciaal belang dat het micro-ponsen op een gestandaardiseerde manier wordt uitgevoerd, aangezien genexpressie en methylering zeer weefselspecifiek zijn. Homogeniseer de biopten in 400 µL guanidiniumthiocyanaatbuffer met behulp van een pipet en vortex vervolgens bij kamertemperatuur.

Breng vervolgens het resulterende lysaat door een spuit met een 29 gauge naald. Herhaal dit meerdere malen totdat de punch niet meer zichtbaar is. Verdeel het lysaat in gelijke delen.

De ene is voor het verwerken van RNA, wat eerst moet gebeuren, en de andere voor het verwerken van DNA, dat op kamertemperatuur bewaard kan worden totdat het RNA is verwerkt voor RNA-purificatie met een volume van 1/10 natriumacetaat, één volume aqua fenol en een half volume chloroform-isoamylalcohol (24:1). Vortex het mengsel krachtig na elke toevoeging en incubeer het uiteindelijke mengsel 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens het mengsel.

Verzamel de waterige fase en voeg hier een gelijk volume 70% ethanol aan toe. Gebruik een RNA spin-column kit. Voer een on-column DNA-digestie uit, was de kolom en elueer het RNA in 25 µL water.

Zuiver nu het DNA met een kit-protocol dat is aangepast om de toevoeging van een RNase-digestie op te nemen, en waarbij de elutiebuffer en de elutiekolom voor gebruik worden verwarmd tot 70 °C. Voor de kolommen is 10 minuten bij 70 °C voldoende. Gebruik tot slot een spectrofotometer om de DNA- en RNA-concentraties te bepalen.

Een typische PVN-punch levert ongeveer 600 nanogram DNA en ongeveer 400 nanogram RNA op; reserveer hiervan ongeveer 100 nanogram RNA voor genexpressieanalyse via kwantitatieve PCR voorafgaand aan amplificatie door bisulfit. Behandel 200 nanogram van het geïsoleerde DNA met een commercieel verkrijgbare kit om DNA uit de gemethyleerde regio's te amplificeren. Bestel primers die specifiek zijn ontworpen voor bisulfit-geconverteerd DNA. Optimaal primerontwerp bij bisulfit-PCR is essentieel, aangezien de kwaliteit en specificiteit van het PCR-amplicon het succes van de volgende stappen bepalen.

Bepaal bij ontvangst van de primers hun optimale annealingtemperatuur met behulp van pilotexperimenten. Gebruik twee µL bisulfietbehandeld DNA als template voor elk PCR-mengsel van 25 µL.

Amplificeer het mengsel, beginnend met zes minuten denaturatie bij 95 °C, gevolgd door 45 tot 50 amplificatiecycli, afsluitend met een finale elongatie van vijf minuten bij 72 °C. Analyseer zeven µL van het PCR-product via agarosegelelektroforese om de grootte van het amplicon te verifiëren. Purificeer het resterende PCR-product voor daaropvolgende ligatie met behulp van een commercieel beschikbare PCR-opreinigingskit.

Indien er ongewenste PCR-producten worden verkregen, gebruik dan gelzuivering om het gewenste product voor dit protocol te isoleren. Er wordt gebruikgemaakt van een commerciële kloneringskit. De kloneringsefficiëntie is sterk afhankelijk van het insert.

Wanneer er herhaaldelijk lage aantallen recombinante klonen worden verkregen, dient een andere kloningsvector te worden geprobeerd. Stel een ligatiereactie van 10 µL op met 1 µL vector en 3 µL gezuiverd PCR-product. Meng de reactie door te pipetteren en incubeer deze overnacht bij 4 °C tot de volgende dag.

Zuiver de ligatiereactie via klassieke ethanolprecipitatie en transformeer de bacteriën met het product. Voeg direct na de pulsafgifte één milliliter voorverwarmd SOB-medium toe en breng de getransformeerde bacteriën over naar een reactiebuisje. Laat de bacteriën één uur herstellen bij 37 °C en verspreid vervolgens 100 µL van elke suspensie op een LB-ampicillineplaat gecoat met IPTG.

Incubeer de platen overnacht totdat de kolonies kunnen worden geplukt. Stel colony PCR-reacties van 25 µL op in een 96-wells plaat, waarbij in elke reactie drie µL van 2,5 mM magnesiumchloride wordt gebruikt. Pluk positieve witte klonen met een pipetpunt en breng deze door middel van een eenvoudige dip over naar een PCR-mix.

Begin de PCR met een smeltcyclus van vier minuten. Volg dit met 10 amplificatiecycli met een annealingtemperatuur van 56 °C. Elke stap van deze cycli duurt 30 seconden.

Verlaag vervolgens de annealingtemperatuur naar 48 °C voor nog eens 30 amplificatiecycli. Sluit af met een elongatiecyclus van vijf minuten. Laad nu 5 µL van elk product op een agarosegel en identificeer de reacties die een insert van de juiste grootte bevatten.

Gebruik een commercieel verkrijgbare kit om de PCR-producten van belang te zuiveren, zodat deze gesequenced kunnen worden middels big dye terminator cycling sequencing. Vul de putjes van een 96-well plaat met drie µL big DI reactiemastermix, gevolgd door twee µL van het gezuiverde kolonie-PCR-product. Voer de reactie uit op een thermocycler, beginnend met één minuut bij 96 °C, gevolgd door 35 cycli van 10 seconden bij 96 °C, vijf seconden bij 50 °C en vier minuten bij 60 °C.

Nadat de bisulfitreactie is voltooid, wordt de reactie opgezuiverd met een bisulfit-zuiveringsplaat. Na het verkrijgen van de sequenties worden deze geanalyseerd met de online bisulfit-analyzer of de B-I-S-M-A-tool om het methyleringspatroon van het onderzochte DNA-gebied af te leiden, om zo inzicht te krijgen in de invloed van vroege stress (early life stress of ELS) op de expressie en methyleringsstatus van avp. C 57 black/6-muizen werden verwerkt volgens het beschreven protocol; de paraventriculaire kern en de supraoptische kern werden uitgestanst om DNA en RNA te isoleren. Het DNA werd behandeld met bisulfit en geamplificeerd met primers die specifiek zijn voor de avp-enhancer, waarna de PCR-producten werden gekloond en gesequenced, waarbij ten minste 20 recombinante klonen per muis werden geanalyseerd.

De PCR-producten werden geanalyseerd om de methyleringsfrequenties te bepalen voor de CpG's in het PCR-amplicon in weefsel van de P-V-N-E-L-S, wat een significante hypomethylering veroorzaakte op vier locaties op de A VP-enhancer, wat wijst op epigenetische markering van deze regulatoire regio door ervaringen in de vroege levensfase. In tegenstelling tot de PVN werd de methylering van de A VP-enhancer in de SON niet beïnvloed door ELS, wat de weefselspecificiteit van het epigenetische effect illustreert. Bij controle-dieren correleerde de DNA-methyleringsstatus op CpG 10 negatief met de VP-genexpressie, wat wijst op een rol van DNA-methylering bij het fijnstellen van de VP-genexpressie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals UPCR, eenvoudig worden uitgevoerd op het geïsoleerde RNA om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals veranderingen in de genexpressie in het geanalyseerde weefsel.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe DNA-methyleringsveranderingen als reactie op omgevings- of ervaringsafhankelijke stimuli kunnen worden bestudeerd.