Ontwikkeling van Bronchiolitis obliterans in een muizenmodel van orthotope longtransplantatie

Het algemene doel van deze procedure is om een iteratief bronchiolitismodel te vestigen dat een orthotope longtransplantatie spiegelt. Dit wordt bereikt door eerst de donorlong te oogsten van een C 57 BL 10 muis. De tweede stap is het voorbereiden van de cuff voor de bronchus, de longslagader en de longader voor anastomose.

Vervolgens wordt de geprepareerde donorlong getransplanteerd in een recipient C57BL/6-muis. De laatste stap is het observeren van de getransplanteerde muis gedurende 21 of 28 dagen na de transplantatie. Uiteindelijk wordt histologische analyse gebruikt om iteratieve bronchiolitis-laesies in de getransplanteerde long aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van dit model in vergelijking met het spiegelende heterotope luchtwegtransplantatiemodel is dat het huidige model de menselijke conditie nabootst. Over het algemeen zullen personen die nog niet bekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat de hogere structuren bij muizen zeer fragiel zijn en vatbaarder voor letsel, aangezien zij slechts een tiende van de massa van de rat hebben. Plaats de donormuis in een afgesloten houdkamer en induceer anesthesie met 5% isofluoraan. Gebruik vervolgens de 20 gauge intraveneuze katheter om de muis te intuberen en plaats deze daarna op een rodentventilator.

Houd de anesthesie in stand met 1 tot 2% isofluoraan. Nadat is vastgesteld dat de muis volledig is geanestheseerd door het uitblijven van een reactie op een staartreflex en een teenknijp, wordt de muis in rugligging geplaatst en wordt de buik voorbereid met 70% alcohol. Snijd vervolgens met een schaar de huid over de buik weg om de buikspieren bloot te leggen.

Voer vervolgens een laparsternotomie uit door eerst een mediane incisie door de bukwand te maken en daarna transversaal door het sternum te snijden; verschuif de darmen en lokaliseer de vena cava inferior, die zich direct onder de lever bevindt. Injecteer heparine in de IVC in een dosis van 100 µL per kilogram. Trek vervolgens het ligamentum falciforme van de lever naar beneden en snijd het diafragma langs de ventrale caudale aanhechting in de richting van de wervelkolom.

Snijd beide zijden van de borstwand door tot aan de nek om de borgholte bloot te leggen. Snijd de ribbenkast bilateraal door terwijl de long wordt beschermd en verwijder de thymus. Snijd vervolgens de intrathoracale IVC door op het niveau van het diafragma.

Lokaliseer nu het hart en exciseer de rechter atriumoor. Maak vervolgens een transversale incisie bij de wortel van de truncus arteriae pulmonalis en gebruik deze incisie om de longen door te spoelen met twee milliliters gekoelde lactaat-Ringer en 0,1 milliliters heparine. Leg de trachea bloot en snijd deze vervolgens samen met de slokdarm weg.

Stop nu de ventilatie op twee derde van het eind-getijdenvolume bij inflatie. Verwijder het hart-longblok en bewaar dit op ijs. Plaats gaas op de verwijderde long om deze tegen licht te beschermen.

Inciteer het longligament tot aan de longader of pv. Verwijder de slokdarm en de aorta om de hilus te lokaliseren. Zoek de longslagader of pa, die zich aan de meest craniale zijde van de hilus bevindt, en de daaraan vastzittende hoofdbronchus.

Dissekeer voorzichtig de arteria pulmonalis weg van de bronchus. Maak nu een PA-manchet van een 24 gauge IV-katheter door deze op een lengte van 0,5 millimeters te knippen met een extensie van 0,7 millimeters. Het oppervlak van de manchet is AB-gevlochten.

Om een oppervlak voor de anastomose te creëren, maakt u een manchet voor de bronchus met materiaal dat vergelijkbaar is met de PA-manchet, maar gebruik hiervoor een katheter van 20 gauge, afgeknipt op een lengte van 1 mm met een verlenging van 0,7 mm. De grootte van de PV-manchet varieert afhankelijk van het gewicht van de donormuis. Voor muizen met een gewicht van 24 tot 27 gram.

De manchetmaat is 22 gauge met een lengte van 0,7 millimeter en een extensie van 0,7 millimeter voor muizen met een gewicht van 27 tot 32 gram. De lengtes zijn gelijk, maar er wordt een 20 gauge katheter gebruikt. Plaats nu de manchetten in het distale lumen van de arteria pulmonalis, de vena pulmonalis en de bronchus, en zet deze elk vast met een 9-0 zijden hechtdraad.

Nadat de manchetten allemaal correct zijn bevestigd, wordt de geprepareerde donorlong in gaas gewikkeld dat is gedrenkt in lactatgerichtringers en op ijs geplaatst tot aan de transplantatie. Om de ontvanger-muis voor te bereiden, wordt anesthesie geïnduceerd en wordt de muis op dezelfde wijze als bij de donor onder mechanische ventilatie geplaatst.

Scheer de linker borstwand en bereid deze voor met 70% alcohol. Begin met het maken van een thoracotomie-incisie in de linker derde intercostale ruimte. Breid de incisie dorsaal uit tot dicht bij de wervelkolom.

Zorg ervoor dat het operatieveld op steriele wijze is afgedekt en plaats een microvatklem op de linkerlongvaten en de bronchus nabij het hart. De arteria pulmonalis kan aan de craniale zijde worden gevisualiseerd, de vena pulmonalis aan het caudale uiteinde van het hilum en de bronchus daartussen. Gebruik vervolgens een hemostat om voorzichtig tractie uit te oefenen, zodat er een lichte spanning op de PA, PV en bronchus komt te staan.

Laat de hilaire structuren afgeklemd en resecteer voorzichtig de linkerlong. Isoleer de arteria pulmonalis, de vena pulmonalis en de bronchus, en plaats vervolgens een hechtdraad losjes rond elke structuur. Disseceer de PA volledig uit zijn adventitiële schede en maak vervolgens een kleine transversale incisie van ongeveer een kwart van de omtrek van het vat in de voorwand.

Terwijl het doorlopende dorsale deel van de arterie intact wordt gelaten, wordt de donorlong, die is ingewikkeld in met koude lactaat-Ringer gedrenkte katoenen gaas, uitgenomen en in de borstholte geplaatst. Plaats vervolgens de cuffs in de pa, PV en bronchus van de ontvanger om de anastomose te creëren en ligeer deze met nanosutuur. Verwijder daarna de long van de ontvanger.

Verwijder vervolgens de hilaire crossclamp, waardoor reperfusie en ventilatie mogelijk worden. Plaats de getransplanteerde long terug in de thorax van de ontvanger en sluit de thoracotomie-incisie met 5-0 hechtmateriaal. De muis moet nu herstellen van de anesthesie. Voor pijnstilling kan buprenorfine worden toegediend zodra de muis weer bij bewustzijn is.

Deze tabel toont de histologische scores van acute afstoting en de prevalentie van obliteratieve bronchiolitis of OB. De score voor acute afstoting na transplantatie wordt aangeduid als een A-score. De allograft-combinaties vertonen aanzienlijk meer pathologie van acute of chronische afstoting in vergelijking met het ISO-transplantaat. Daarnaast was de prevalentie van obliteratieve bronchiolitis op dag 21 en 28 na transplantatie significant hoger in de allograft-combinaties dan in het ISO-transplantaat.

De macroscopische bevindingen en histopathologie 28 dagen na longtransplantatie worden hier getoond. Deze afbeeldingen representeren de macroscopische bevindingen en H&E-gekleurde ISO-transplantatie-longen en de rechter naïeve long. Deze afbeeldingen representeren H&E- en Masson's trichroom-gekleurde BL 10 longallotransplantaten in een BL 6 muisontvanger, die respectievelijk OB en non-OB ontwikkelden.

De witte pijl in paneel B identificeert de OB-laesies. Dit paneel toont een BL 6 longallograft getransplanteerd in een BL 10 muisontvanger. Eenmaal beheerst kan deze techniek in bijna een half uur worden uitgevoerd als deze correct wordt toegepast.

Het nut van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om mechanistische vragen te beantwoorden over primaire graftdysfunctie, acute afstoting en ablatieve bronchiolitis na een longtransplantatie.