Solubilisatie en Bio-vervoeging van Quantum Dots en bacteriële toxiciteit Testen door de groeicurve en Kiemgetal

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van high-throughput screening van de antibacteriële effecten van nanodeeltjes met of zonder conjugatie aan antibiotica. Hier worden de antibacteriële effecten van poly mix en B, geconjugeerde cadmiumtelluride-quantumdots getest om dit te bereiken. De quantumdots worden eerst gesolubiliseerd in me, capto-propionzuur.

Vervolgens worden de quantum dots geconjugeerd aan poly mix en B; de op platen uitgeplaatte antibiotica-behandelde bacteriën worden daarna behandeld met zowel geconjugeerde als niet-geconjugeerde antibioticum-quantum dots. De helft van de monsters wordt bestraald met blauw licht van 440 nanometer gedurende 30 minuten, waardoor de quantum dots excitonen en reactieve zuurstofspecies genereren om het effect van de quantum dot-behandelingen op de bacteriële groei en overleving te beoordelen. Er worden optische dichtheidsmetingen verricht en kolonietellingen uitgevoerd. De resulterende gegevens geven aan dat de toepassing van antibioticum-geconjugeerde cadmiumtelluride quantum dots, gevolgd door bestraling, de grootste biocidale effecten oplevert van alle geteste condities.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in het effect van cadmiumtelluride quantum dots en hun conjugatie aan poly-L-lysine op de groei van E. coli, kan zij ook worden toegepast op andere typen nanodeeltjes en antibiotica bij diverse bacteriestammen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat elk overschot aan MPA zal leiden tot aggregatie van de quantum dots, en indien zij zelfs een kleine hoeveelheid toluene pipetteren, zij het filter zullen vernietigen.

Hoewel we vandaag een methode zullen demonstreren voor het beoordelen van de antibacteriële effecten van antibioticaconjugeren KE IDE quantum dots, zou een vergelijkbare methode kunnen worden gebruikt met andere typen quantum dots, zoals indiumfosfaat, zinksulfaat en cadmiumjodide-zinksulfaat. Begin deze procedure door een oplossing van cadmiumtelluride of CDTE quantum dots in tolueen met een concentratie van 15 µM in een glazen vial te bereiden; meet de optische dichtheid of OD via absorptiespectroscopie en breng met een pipet 200 µL van deze stockoplossing over naar een glazen vial.

Gebruik geen plastic. Voeg vervolgens 800 µL tolueen, 1 mL 200 mM boraatbuffer en 2 µL 11,5 M mercaptopropionzuur of MPA toe; sluit het flaconnetje en schud dit krachtig gedurende 30 tot 60 seconden. Na het schudden zullen de waterige en organische solventfasen spontaan scheiden.

De waterfase krijgt de kleur van de quantum dots. Om de tilingslaag te vermijden, verwijdert u deze, vervolgens verwijdert u de quantum dots-fase en brengt u deze over naar een schoon vial. Om de gesolubiliseerde quantum dots te zuiveren, brengt u deze over naar een 500 microliter centrifugefilter.

Voeg 100 µL 50 mM bore eight-buffer toe en centrifugeer bij 3000 ×g gedurende 13 minuten. Voer deze wasstap vier keer uit. Resuspendeer de gewassen quantum dots in 500 µL bore-buffer en bewaar deze bij 4 °C.

Ze blijven één tot twee weken stabiel. Om de concentratie van de quantum dots te schatten, worden de absorptie- en emissiespectra gemeten. Deze figuur toont CDTE quantum dots onder UV-lampverlichting en de emissiespectra vóór en na wateroplosbaarheid, waarbij een verwaarloosbare verandering in de optische eigenschappen door de liganduitwisseling te zien is.

Dit deel van het protocol is van toepassing op elk negatief geladen gesolariseerd water-nanodeeltje, waaronder mos, commerciële quantum dots, metaaldeeltjes en meer. In dit voorbeeld zal het antibioticum polymyxine B of PMB worden geconjugeerd aan de quantum dots met een molaire ratio van 30 op één. PMB is positief geladen en assembleert zichzelf zonder dat conjugatie nodig is. Reagentia: los PMB op in water.

Bij 60 µM. Voor een 96-wells plaat met 0,3 mL bacteriën per well in viervoudige duplicaten. 0,5 mL van 200 nM conjugaat is voldoende om dit te bereiden door 100 µL van 1 µM quantum dots in 50 mM bore buffer aan een microcentrifugebuis toe te voegen.

Voeg vervolgens 50 µL van de 10x of 60 µM PMB-antibioticumoplossing in water toe aan de conjugaatbuis. Voeg 50 µL water toe aan de controlebuis. Vul het volume aan tot 0,5 mL met 50 mM ate-buffer. Bescherm de buizen tegen licht met aluminiumfolie en plaats ze gedurende één uur op een rotator.

Indien er aggregatie optreedt, herhaal de conjugatie dan met lagere concentraties antibioticum. Titreer de concentratie naar boven totdat de particles niet aggregeren om de conjugaten te wassen. Giet de oplossingen door een filter met een molecuulgewicht-afsnijpunt van 10.000, wat geschikt is voor de meeste antibiotica, maar niet voor eiwitten of antilichamen.

Schat ten slotte het aantal antibioticamoleculen per quantum dot in door middel van absorptie- of fluorescentiespectroscopie, gelelectroforese of Fourier-transform infraroodspectroscopie. Deze figuur toont de typische absorptie- en emissiespectra van de quantum dots vóór conjugatie van PMB en de emissie na toevoeging van 160 molaire equivalenten PMB.

Hier wordt de relatie weergegeven tussen de ratio van PMB en de emissie-intensiteit van de quantum dot, aangegeven door de vierkantjes, en de locatie van de piekgolflengte, aangegeven door de driehoekjes. Naarmate de PMB-concentratie toeneemt, neemt de QD-emissie-intensiteit af, wat resulteert in een verschuiving van de piek-emissiegolflengte. Het volgende deel van het protocol wordt uitgevoerd om de halfmaximale remmende concentratie of IC 50 van het antibioticum en de quantumtoxiciteit te bepalen, in de avond van twee dagen voor het conjugatie-experiment.

Ent 10 milliliter LB-medium met een verse kolonie e. coli. Vul de volgende dag, één tot twee uur vóór het experiment, elke well van een transparante 96-wells plaat. Met groeimedium moet de assayplaat worden ingericht zoals hier getoond.

Monsters moeten in triplikaat worden geplaatst en de antibioticaconcentraties moeten een breed genoeg bereik beslaan om zowel een concentratie die de bacteriën nauwelijks remt als een concentratie die ze volledig doodt, te bevatten. Alle wells met quantum dots in de concentraties die in de conjugaatexperimenten worden gebruikt, moeten eveneens in triplikaat worden opgenomen. Vul met een meerkanaalspipet de betreffende wells met 1 tot 50 µL bacteriële cultuur.

De concentratie is afhankelijk van de groeisnelheid van de specifieke stam en moet dienovereenkomstig worden gekalibreerd. Om de groei te monitoren, plaatst u de plaat in een plaatlezer en stelt u deze in om elke 10 minuten gedurende twee uur te meten bij 600 nanometers. Wanneer de cellen allemaal een OD van 0,1 tot 0,15 bereiken, verwijdert u de plaat uit de plaatlezer en stopt u de registratie.

Voeg vervolgens de PMB in quantum dots toe aan de betreffende wells en scherm de helft van de plaat in triplo af met aluminiumfolie. Plaats de plaat daarna gedurende 30 minuten onder een op maat gemaakte 440 nanometer lamp bestaande uit 2,4 milliwatt LEDs om de verlichte zijde van de plaat te belichten. Plaats de plaat na de lichtblootstelling in de platenlezer en registreer de OD 600 elke 10 minuten gedurende vijf tot 12 uur, afhankelijk van de groeisnelheid. Houd de temperatuur indien mogelijk via de software onder de 32 degrees Celsius om uitdroging van de culturen te voorkomen.

Zet de groeicurven uit tegen de logaritme van de concentratie op een geselecteerd tijdstip en bepaal de IC 50 van het antibioticum met behulp van de op het scherm getoonde Hill-vergelijking, waarbij H de Hill-coëfficiënt is. Y max is het hoogste groeipunt en Y min is een nulpunt, bij voorkeur ook op een plateau. Aan het einde van de registratieperiode zullen heldere wells wijzen op volledige celdood en zou er een gradiënt van celdichtheid moeten verschijnen bij toenemende concentraties van het drug.

De bacteriën moeten S-vormige groeicurves vertonen, zoals hier getoond. De locatie van het maximale plateau zal sterk variëren per stam en is daarnaast afhankelijk van de temperatuur. Een specifiek tijdstip kan als representatief worden gekozen, waarbij de waarden worden uitgezet tegen de logaritme van het antibioticum om de IC 50 te bepalen voor de evaluatie van quantum dots.

De overleving bij toxiciteit tegenover de logaritme van de quantum dot-concentratie kan ook worden uitgezet, maar het is zeldzaam om met alleen quantum dots bij de gebruikte concentratie een significante bacteriële doding te bereiken. Zodra de toxiciteit van de quantum dots en antibiotica afzonderlijk is bepaald, kan hetzelfde protocol worden toegepast om de toxiciteit van het antibioticum te bepalen. Geconjugeerde quantum dots worden getoond.

Hier is een voorbeeldindeling voor de assay. Let erop dat de conjugaten worden getest in toenemende concentraties in quad-duplicaten; een controlestrip met alleen bacteriën, een strip met alleen het geneesmiddel en monsterputjes voor alleen quantum dots moeten worden opgenomen. OD 600-metingen kunnen vervolgens worden gebruikt om groeicurves te genereren, en ik zie 50 waarden zoals voorheen.

Deze figuur toont een voorbeeld van conjugaten die even toxisch zijn als het antibioticum alleen en een voorbeeld van conjugaten die toxischer zijn. Om het aantal colony forming units of CFU voor elke conditie te bepalen, kiest u één of meer wells van de behandelde 96-wells plaat om plaat tellingen uit te voeren. Maak een seriële verdunning van elk van de geselecteerde bacteriële monsters met een zoutoplossing.

Pipetteer hiervoor 180 µL zoutoplossing in de juiste kolommen. Breng 20 µL van de bacteriële oplossing over en verdun deze met 180 µL zoutoplossing. Vervang de pipetpunt, meng en breng 20 µL van de verdunde bacteriële oplossing over naar 180 µL zoutoplossing.

Herhaal dit proces zes keer. Neem vervolgens telkens 10 µL van de laatste zes verdunningen en breng deze aan op een rechthoekige augerplaat. Er kunnen 36 spots op een rechthoekige plaat worden aangebracht.

Laat de plaat 15 minuten aan de lucht drogen; incubeer de plaat vervolgens 16 uur bij 37 graden Celsius. Tel de koloniën om het aantal kolonievormende eenheden per milliliter te bepalen. Vermenigvuldig het aantal koloniën met de verdunningsfactor en deel dit door het geplaatste volume om het effect van de behandelingen op de bacteriële groei te bepalen.

De celdichtheid van e coli werd gemeten bij OD 600. Hier worden representatieve bacteriële groeicurves getoond met verschillende drugconcentraties, van nul tot volledige celdood. De open symbolen representeren enkel PMB, waarbij de concentraties zijn aangegeven.

De gevulde symbolen staan voor C-D-T-E-P-M-B zonder bestraling en de halfgevulde symbolen staan voor C-D-T-E-P-M-B met bestraling. Bestraling had geen effect op de monsters met alleen PMB, dus deze curven zijn weggelaten voor een duidelijkere weergave. Hier zijn grafieken van de groeicurvewaarden op 200 minuten tegenover log PMB en fits aan deze vergelijking om IC 50-waarden te bepalen om te controleren voor de effecten van licht.

Er is een curve gemaakt met alleen antibiotica en een lichtblootstelling van 30 minuten. Deze figuur geeft de bacteriële overleving na 200 minuten weer tegenover de QD-concentratie met gebruik van CDTE qds. Er is enige toxiciteit zichtbaar bij lichtblootstelling, maar te weinig om een IC 50-waarde te bepalen.

Dit geeft aan dat de toxiciteit van CDTE alleen bij de concentraties die in het conjugatie-experiment zijn gebruikt, verwaarloosbaar is om de effecten van verschillende behandelingen op de celgroei te vergelijken; de waarden van de groeicurve na 200 minuten zijn uitgezet en gefit volgens de eerder getoonde vergelijking, zoals hier weergegeven. C-D-T-E-P-M-B-conjugaten waren toxischer dan PMB alleen. In vergelijking hiermee vertonen gouden nanodeeltjes A-U-P-M-B-conjugaten geen verhoogde toxiciteit ten opzichte van PMB alleen om het effect van behandelingen op het bacterie-overlevingspercentage te bepalen.

Het aantal colony forming units werd bepaald voor e coli in een 96-wellplaat behandeld met P-M-B-Q-D-P-M-B of alleen QD, met of zonder I-straling gedurende 30 minuten, en vervolgens geïncubeerd bij 32 °C gedurende vier uur. Seriële verdunningen van elk bacterieel monster werden gemaakt met een zoutoplossing en 10 µL van de 100 x tot 10⁷ X oplossingen werden op agarplaten geplaatst. De platen werden geïncubeerd bij 37 °C en de kolonies werden na 16 uur geteld.

In dit voorbeeld zijn de plaatkolommen A tot en met C bacteriën behandeld met toenemende concentraties CDTE. Conjugaten zonder bestraling en D tot en met F zijn bacteriën behandeld met toenemende concentraties conjugaten. Samen met 30 minuten bestraling worden de verdunningen langs de rijen weergegeven.

De gegevens geven aan dat de conjugaten na bestraling een sterkere remming van de bacteriële groei vertonen in vergelijking met de conjugaten zonder bestraling. Houd er rekening mee dat ca-reagentia uiterst toxisch zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, laboratoriumjassen en veiligheidsbrillen, tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van high-throughput screening naar het antibacteriële effect van nanodeeltjes met of zonder conjugatie aan antibiotica.