Video-oculografie in Muizen
19 juli 2012
Video-oculografie is een zeer kwantitatieve methode om oculaire motorische prestaties te onderzoeken en motorisch leren. Hier beschrijven we hoe je video-oculografie te meten bij muizen. De toepassing van deze techniek op een normale, farmacologisch behandeld of genetisch gemodificeerde muizen is een krachtig onderzoeksinstrument om de onderliggende fysiologie van de motor gedrag te verkennen.
Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van video-oculografie bij muizen. Dit wordt bereikt door de muis eerst te voorzien van een pedeseal-constructie op de schedel, waardoor de kop geïmmobiliseerd kan worden in een speciale fixatiehouder voor de kop. De tweede stap is het plaatsen van de muis in de video-oculaire opstelling en het kalibreren van het video-pupilstrackingsysteem.
Vervolgens worden oogbewegingen geregistreerd terwijl het oculomotorische systeem wordt geactiveerd met een groot repertoire aan vestibulaire en optokinetische stimuli. De laatste stap is het analyseren van deze oogbewegingen. Uiteindelijk kan video-oculografie bij normale, farmacologisch behandelde of genetisch gemodificeerde muizen worden gebruikt om de fysiologie van motorisch gedrag te onderzoeken.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het occulomotorische systeem, kan deze ook worden toegepast om ziekten met een cerebellaire, vestibulaire of occulaire oorsprong te bestuderen door gebruik te maken van muismutanten die menselijke pathologieën nabootsen. Om met deze procedure te beginnen, wordt de muis in een gaskamer geanestheseerd met een mengsel van isofluraan, fluor en zuurstof. Houd de anesthesie vervolgens in stand door het gas via een masker toe te dienen.
Gebruik vervolgens een warmtemat en een anale thermosensor om de lichaamstemperatuur van de muis op 37 °C te houden. Breng daarna oogzalf aan om uitdroging van de ogen te voorkomen, scheer de vacht op de dorsale schedel en reinig het operatiegebied. Maak vervolgens een incisie in de middenlijn om het dorsale schedeloppervlak bloot te leggen, en reinig en droog dit oppervlak.
Breng vervolgens een druppel fosforzuur van bgma aan op Lambda. Verwijder na 15 seconden het etsmiddel, maak het schedeloppervlak vervolgens schoon met een zoutoplossing en droog het opnieuw. Breng een druppel opti bond prime aan op de bovenkant van het geëtste schedeloppervlak en droog dit met lucht.
Droog het gedurende 30 seconden. Voeg vervolgens een druppel OptiBond-adhesief toe bovenop de OptiBond-prime. Polymeriseer dit gedurende één minuut met UV-licht.
Bedek daarna de adhesielaag met een dunne laag charisma-composiet. De connector met het schroefgat voor de magneet en de bevestigingspunten worden in het composiet ingebed. Polymeriseer vervolgens het composiet met UV-licht.
Breng indien nodig opnieuw extra lagen composiet aan en polymeriseer deze met licht. Laat de muis na de operatie ten minste drie dagen herstellen. De volgende stap is om de muis in de fixatiehouder te plaatsen en de kop met de magneet en één schroef aan de houder te bevestigen; monteer de kop- en lichaamshouder van de muis op een XY-platform.
Plaats met behulp van het XY-platform de kop van de muis boven het midden van de draaischijf, zodat de muis over de pitch Ya- en roll-assen kan worden bewogen. Plaats de kop vervolgens in de juiste pitch ya- en roll-hoek door het oog uit te lijnen met behulp van het visuele beeld van het oog dat door het oogscansysteem wordt gegenereerd. De draaischijf is nu verbonden met een AC-servogestuurde motor.
De positie van de draaischijf wordt gemonitord met een potentiometer die aan de as van de draaischijf is bevestigd. De draaischijf is omvat door een cilindrisch scherm met een random dot-patroon, dat eveneens is uitgerust met een AC-servogestuurde motor. De positie van het cilindrische scherm wordt gemonitord door een potentiometer die aan de as daarvan is bevestigd.
Het scherm kan worden verlicht door een halogeenlamp. De beweging van de draaitafel en het omliggende scherm wordt aangestuurd door een computer die is verbonden met een input-outputinterface. De positioningsignalen van de draaitafel en het omliggende scherm worden gefilterd door een digitale input-outputinterface met een afsnijfrequentie van 20 hertz en op deze computer opgeslagen.
Het oog van de muis wordt verlicht door drie infrarode emitters. Twee hiervan zijn bevestigd aan de draaischijf en de derde is aan de camera bevestigd. Deze derde emitter produceert een referentie-corneale reflectie, die wordt gebruikt tijdens de kalibratieprocedure en tijdens de registraties van de oogbewegingen.
Een infrarood CCD-camera uitgerust met een zoomlens is bevestigd aan de draaischijf en is gefocust op de kop van de muis in het midden van de draaischijf. De camera kan worden ontgrendeld en over een traject van precies 20 graden rond de as van de draaischijf worden verplaatst.
Tijdens de kalibratieprocedure wordt het videosignaal verwerkt door een eye-tracking-systeem, dat de pupil en de referentie-hoornvliesreflectie in horizontale en verticale richting kan volgen met een bemonsteringssnelheid van 120 hertz. Vervolgens worden de signalen voor de referentiepositie van het hoornvlies, de pupilpositie en de pupilgrootte gedigitaliseerd door de input-outputinterface en opgeslagen in hetzelfde bestand als de tabel- en omringende schermpositie-signalen om de oogbewegingen te kalibreren. Stel de hoofdpositie van de muis ten opzichte van de camera zo in dat het videobeeld van de pupil zich in het midden van de monitor bevindt en de weergave van de referentie-hoornvliesreflectie zich op de verticale middellijn van het oog direct boven de pupil bevindt.
Verplaats vervolgens de camera meerdere keren met een uitslag van 20 graden. Draai rond de verticale as van de draaischijf. Gebruik de posities van de gevolgde pupil en het hoornvliesreferentiepunt die zijn geregistreerd in de uiterste posities van de camera om de straal van de pupilrotatie te berekenen.
Herhaal deze stappen meerdere keren onder verschillende verlichtingsomstandigheden om de relatie tussen de pupilgrootte en de rotatie van de pupil te bepalen. Stel vervolgens een correctiecurve voor de pupilrotatie op. Bereken nu de hoekpositie van het oog door de referentiepositie van het hoornvlies, de pupilpositie en de pupilgrootte te meten.
De waarde van de pupilrotatie kan worden geëxtraheerd uit de rotatiecorrectiecurve van de pupil, en de hoekpositie van het oog kan worden berekend met behulp van de volgende formule. Het VVOR-oogbewegingsexperiment wordt hier gedemonstreerd. Zet nu de oogposities, tafelposities en omringende schermposities om in hoekposities.
Differentieer vervolgens de hoekposities van de oogtafel en het omringende scherm en filter deze met een Butterworth laagdoorlaatfilter. Verwijder met een afsnijfrequentie van 20 hertz sub de seconden uit het oogsnelheidssignaal met een detectiedrempel van 40 graden per seconde. Bereken daarna het gemiddelde van de tafel- en oogsnelheidssignalen voor elke individuele cyclus in de trial en fit de gemiddelde signalen met een passende functie.
Over het algemeen wordt een sinusvormige snelheidsstimulatie gebruikt en worden de gemiddelde cycli gefit met een sinus- of cosinusfunctie. Deze video laat zien hoe oogbewegingen worden opgewekt door de rotatie van het omringende scherm om de optokinetische reflex te triggeren, waarbij het omringende scherm wordt geroteerd over een frequentiebereik van 0,2 tot 1 Hz met een amplitude van 1,6 graden. Er wordt aangetoond dat het optokinetische systeem van de muis efficiënter is in het lage frequentiebereik dan in het hoge frequentiebereik.
Hier is een andere video die laat zien hoe de oogbewegingen worden gegenereerd. Door de muis in het donker te roteren om de vestibulo-oculaire reflex op te wekken, waarbij de draaitafel over een frequentiebereik van 0,2 tot 1 Hz wordt gedraaid met een amplitude van 1,6 graden. Het vestibulo-oculaire systeem van de muis blijkt efficiënter in het hoge frequentiebereik dan in het lage frequentiebereik.
Hier wordt een andere video getoond over hoe oogbewegingen worden opgewekt door de muis in het licht te roteren om een visueel versterkte vestibulo-oculaire reflex te veroorzaken. Terwijl de draaischijf over een frequentiebereik van 0.2 tot 1 Hz wordt geroteerd met een amplitude van 1.6 graden en het omringende scherm goed verlicht is, blijkt dat de muis efficiënte compenserende oogbewegingen genereert over het gehele frequentiebereik. En deze video laat zien hoe motorisch leren werd bereikt door de vestibulo-oculaire reflex adaptief te verhogen. Met behulp van een tegenfase-trainingsparadigma verhoogt het roteren van de draaischijf in tegenfase met het omringende scherm de VOR-gain van deze muis.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een video-oculografie bij muizen uitvoert.
Overzicht
Dit artikel beschrijft de procedure voor het uitvoeren van video-oculografie bij muizen, een kwantitatieve methode voor het onderzoeken van de oogmotoriek en motorisch leren. De techniek kan worden toegepast op normale, farmacologisch behandelde of genetisch gemodificeerde muizen om de fysiologie van motorisch gedrag te onderzoeken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oculaire motorische prestaties
- Motorisch leren
Achtergrond
- Video-oculografie is een methode die wordt gebruikt om oogbewegingen te bestuderen.
- Deze techniek biedt inzicht in het oculomotorische systeem.
- Het kan ook worden ingezet om ziekten met een cerebellaire of vestibulaire oorsprong te bestuderen.
- Muismodellen kunnen menselijke pathologieën nabootsen voor onderzoeksdoeleinden.
Doel van de studie
- Om oogbewegingen bij muizen te meten en analyseren.
- Om de onderliggende fysiologie van motorisch gedrag te onderzoeken.
- Om de methode toe te passen op diverse muismodellen voor ziekteonderzoek.
Gebruikte methoden
- Voorzie de muis van een voetstuk voor immobilisatie van de kop.
- Kalibreer het video-pupiltrackingsysteem.
- Registreer oogbewegingen met behulp van vestibulaire en optische stimuli.
- Analyseer de geregistreerde oogbewegingen voor fysiologische inzichten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kalibratie van het eye-tracking systeem.
- Registratie van oogbewegingen onder verschillende stimuluscondities.
- Data-analyse die inzichten verschaft in de fysiologie van het motorisch gedrag.
- Toepassing van de methode voor het bestuderen van ziekten van het oculomotorische systeem.
Conclusies
- Video-oculografie is een krachtig instrument voor het bestuderen van oogbewegingen.
- De methode kan het begrip van motorisch leren en prestaties verbeteren.
- Het biedt potentieel voor het onderzoeken van ziekten die het oculomotorische systeem beïnvloeden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Video-oculografie bij muizen biedt een kwantitatieve gedragsmatige weergave voor het beoordelen van de oculomotorische functie, wat een mechanische risicoanalyse mogelijk maakt van targets die betrokken zijn bij vestibulaire, cerebellaire en oculaire motorische pathways. De methode ondersteunt targetvalidatie door genetische of farmacologische manipulaties te koppelen aan meetbare veranderingen in reflexmatige oogbewegingen, wat zorgt voor predictieve zekerheid in vroege discoveryfasen. De toepasbaarheid op ziektespecifieke modellen verbetert de translationele continuïteit voor pipelines voor neuropsychiatrische en neurodegeneratieve aandoeningen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen die zich richten op de vestibulaire, cerebellaire en oculaire motorische systemen te onderzoeken via kwantificeerbare gedragsfenotypes.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare, high-throughput-compatibele assay voor het screenen van genetische en farmacologische modulatoren van motorisch gedrag.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de functie van het oculomotorische circuit te isoleren van storende motorische of motivationele variabelen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (oogsnelheid, gain, fase), wat dosis-respons- en genotype-fenotype-correlaties mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde kalibratie- en trackingprotocollen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en de gereedheid van de assay voor de evaluatie van verbindingen.
- Wetenschappelijke waarde: De resultaten ondersteunen mechanistische risicoreductie door vestibularaire, optokinetische en visueel versterkte VOR-bijdragen aan de motorische controle te onderscheiden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ziekte-relevant systeem: muismodellen die menselijke vestibulaire, cerebellaire of oculaire pathologieën nabootsen, maken een directe translationele afstemming van biomarkers mogelijk.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van motorisch leren en adaptieve plasticiteit mogelijk, wat de preklinische validatie van cognitieve en motorische therapeutica ondersteunt.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang door functioneel herstel of de progressie van deficiënties in genetische modellen te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows als een fenotypische screeningstool voor targetvalidatie, waarbij de resultaten bijdragen aan beslissingen over leadidentificatie en preklinische voortgang op basis van de integriteit van het oculomotorische systeem.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en het verduidelijken van signaalpaden door de vestibulaire en optokinetische bijdragen aan de controle van oogbewegingen te isoleren.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door middel van gestandaardiseerde hoofdfixatie, kalibratie en stimulusafgifte, waardoor betrouwbare evaluatie van verbindingen of genotypen mogelijk is.
- Analytics: Biedt kwantitatieve read-outs (angulaire oogpositie, snelheid, gain) die gefilterd en gefit zijn aan sinusvormige stimuli voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via toepasbaarheid op ziektemodellen, waardoor de therapeutische impact op motorische gedragstypes kan worden beoordeeld.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor multidisciplinaire teams die motorisch leren, balansstoornissen en neuropsychiatrische indicaties bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in target engagement door meetbare veranderingen in de winst en fase van VOR, OKR en VVOR.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde chirurgische voorbereiding, hoofdimmobilisatie en infraroodtracking waarborgen reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdspunten.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's in een laat stadium door vroege detectie van motorische circuitdysfunctie in genetische of farmacologische modellen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door oculomotorische prestaties te kwantificeren als een biomarker voor de integriteit van neurale circuits.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie, het implanteren van hoofdplaten en infrarood-oculomotorische trackingsystemen.
- Afhankelijk van gespecialiseerde apparatuur, waaronder XY-platforms, servo-gestuurde draaitafels, infraroodemitters en high-speed CCD-camera's.
- Vereist cross-team standaardisatie van chirurgische protocollen, kalibratieprocedures en stimulusparameters voor reproduceerbare resultaten.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten modelspecifieke aanpassingen voor muizenstam, gewicht en oculaire pigmentatie die de nauwkeurigheid van de infraroodtracking beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten de postoperatieve hersteltijd en potentiële storende factoren door anesthesie of ontsteking die de baseline oculomotorische functie beïnvloeden.
