Het beheersen van de grootte, vorm en stabiliteit van de supramoleculaire polymeren in water

Het algemene doel van het volgende experiment is het beheersen van de grootte, vorm en stabiliteit van supermoleculaire dynamische nanodeeltjes in water. Dit wordt bereikt door het ontwerp van zelf-assemblerende of polymeriserende dichotische amfifielen waarvan de moleculaire structuur is voorzien van zowel attractieve als repulsieve interacties. Dit resulteert in een gefrustreerd groeimechanisme dat leidt tot zelf-geassembleerde nanodeeltjes in water met een gecontroleerde sferische vorm.

Als tweede stap wordt de zoutconcentratie van de waterige oplossing verhoogd, waardoor de afstotende interacties die zijn gecodeerd in de moleculaire structuur van de disco amphi worden verzwakt. Dit induceert een overgang van bolvormig naar staafvormig; er worden temperatuurafhankelijke circulaire dichroïsme- (CD) spectroscopische onderzoeken uitgevoerd om de onderliggende mechanismen van deze overgang van bol naar staaf te onthullen. Daarnaast wordt een combinatie van analytische technieken, zoals cryogene transmissie-elektronenmicroscopie en kernspinresonantie, gebruikt om de overgang van het ene type aggregaat naar het andere te meten en te visualiseren. Er worden resultaten verkregen die aantonen dat de overgang van bol naar staaf zich uit in een versterkte coöperativiteit in de supramoleculaire polymerisatie.

Dit vindt zijn oorsprong in een overgang van een anti-coöperatief proces in nanodeeltjes van beperkte grootte naar een volledig coöperatief nucleatie-elongatiemechanisme dat in dit geval leidt tot zeer grote supramoleculaire polymeren, namelijk dynamische nanostaven. Het belangrijkste voordeel van het combineren van spectroscopische technieken zoals CD-spectroscopie, kleinhoekige röntgenverstrooiing en dNMR met microscopische technieken zoals cryo-EM, is dat het mogelijk maakt om overgangen van supramoleculaire polymeren in water te meten en te visualiseren. Deze dynamische polymeren kunnen reageren op externe stimuli, zoals veranderingen in de temperatuur, veranderingen in de ionsterkte of veranderingen in de pH.

De combinatie van deze methoden is breed toepasbaar en kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de moleculaire chemie en zelfgeassembleerde nanomaterialen. Zo kan bijvoorbeeld de correlatie tussen de afmetingen van de aggregaten die zijn gevormd door de zelfassemblage van kleine moleculaire bouwstenen en de onderliggende vormingsmechanismen worden onderzocht. De implicaties van deze methodologie strekken zich uit tot een breed scala aan bionanotechnologische toepassingen.

We zijn in het bijzonder geïnteresseerd in het gebied van biomedische beeldvorming en de ontwikkeling van zelf-assemblerende nanoparticulaire contrastmiddelen, waarbij een nauwgezet evenwicht tussen aggregaatstabiliteit, hoog contrast en het vermogen om de zelf-assemblerende contrastmiddelen uit te scheiden van cruciaal belang is voor hun succes bij klinisch gebruik. We kregen aanvankelijk het idee om karakteriseringstechnieken te combineren toen we beseften dat subtiele veranderingen in de moleculaire structuur van de zelf-assemblerende bouwstenen kunnen leiden tot fundamentele verschillen in het mechanisme van de supramoleculaire polymerisatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Paul Beaumont, de expert die verantwoordelijk is voor de cryo-EM-faciliteiten aan de Technische Universiteit van Trovan.

Begin dit protocol door een BTA gadolinium DTPA-oplossing in 100 millimolaire citraatbuffer te bereiden zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Vul, ter begeleiding van deze video, een UV Q-cuvet van één centimeter met de oplossing. Plaats de cuvet in de cuvethouder van de circulaire dichroïsmespectrometer.

Meet een CD-spectrum van 230 tot 350 nanometer. Meet vervolgens een CD-koelingscurve bij de CD-band met de hoogste intensiteit van 363 tot 283 kelvin met een snelheid van één kelvin per minuut. Voeg daarna hetzelfde volume van een twee molar natriumchloride-gebufferde oplossing toe aan de citraatgebufferde oplossing van BTA gadolinium DTPA.

Dit zal de ionsterkte verhogen tot één molair natriumchloride en de disco's verdunnen tot de helft van de concentratie. Vortex de oplossing met de verhoogde ionsterkte gedurende 40 seconden na de verhoging van de ionsterkte, en meet opnieuw een CD-spectrum van 230 tot 350 nanometer. Meet vervolgens een CD-koelingscurve bij de CD-band met de hoogste intensiteit van 363 tot 283 kelvin met een snelheid van één kelvin per minuut.

Exporteer de ruwe CD-gegevens naar Origin 8.5. Normaliseer de spectra door het CD-effect bij de hoogste gemeten temperatuur op nul te stellen en het CD-effect bij de laagste gemeten temperatuur op één, aangezien de magnitude van het CD-effect proportioneel is aan de graad van aggregatie; de genormaliseerde CD-curves zijn daarmee proportioneel aan de graad van aggregatie. De genormaliseerde gegevens worden gefit met een optie voor niet-lineaire curvefitting in Origin Pro 8.5 met een temperatuurafhankelijk zelfassemblagemodel.

In dit model wordt onderscheid gemaakt tussen een nucleatieregime en een elongatieregime. Pas eerst de aggregatiegraad in het elongatieregime aan. In deze vergelijking vertegenwoordigt T de variabele temperatuur.

PHI N is de netto heliciteit, die proportioneel is aan de aggregatiegraad, en HE is de moleculaire enthalpie van verlenging. T TE vertegenwoordigt de verlengingstemperatuur, wat de temperatuur is waarbij de zelfassemblage thermodynamisch gunstig begint te worden. De normalisatiefactor fiat is geïntroduceerd om ervoor te zorgen dat Phi N gedeeld door fiat de eenheid niet overschrijdt, wat voortvloeit uit de beperking dat de aggregatiegraad niet verder kan toenemen.

Unity-fitting maakt het mogelijk om de elongatie-enthalpie in joules per mol en de elongatietemperatuur in Kelvin te extraheren, die de zelfassemblage van de moleculen voor een gegeven concentratie kenmerken. Houd bij het fitten de beperking in acht dat alleen de aggregatiegraad bij temperaturen onder TE gefit moet worden, aangezien de vergelijking alleen geldig is in het elongatieregime. Na het fitten van de eerste vergelijking is de enige onbekende parameter in de vergelijking voor het nucleatieregime de activeringsconstante ka, die de coöperativiteit van de supramoleculaire polymerisatie beschrijft. Om de activeringsconstante te bepalen, fit u de experimenteel vastgestelde aggregatiegraad voor temperaturen boven TE in het nucleatieregime.

Begin met het klaarmaken van de oplossingen voor elektronenmicroscopie zoals beschreven in de tekst. Bereid kortstondig twee buffers voor: een 100 millimolaire citraatbuffer en een 100 millimolaire citraatbuffer met vijf molair natriumchloride. Los BTA gadolinium DTPA op in 0,1 milliliter van elke bereide buffer om een uiteindelijke concentratie van één millimolair te verkrijgen. Behandel vervolgens een QuantiFoil koolstofgecoate grid met plasma met behulp van een C Resington 2 0 8 koolstofcoating bij vijf milliampère gedurende 40 seconden.

De vitrificatieprocedure is een cruciale stap van de cryo-preparatie, aangezien deze waarborgt dat er een dunne laag glanzend ISIS wordt geproduceerd die geschikt is voor TAM-analyse. De waterige oplossing wordt tijdens de vitrificatie op het raster aangebracht met een geautomatiseerde FEI vitro bot. Dit omvat het aanbrengen van de sample op het raster, het wegnemen van overtollige vloeistof om een dunne film van de waterige oplossing op het raster te creëren en de daaropvolgende vitrificatie door het raster zeer snel in vloeibaar ethaan te dompelen.

Na de vitrificatie wordt het behandelde raster overgebracht naar vloeibare stikstof om het te bewaren, waarna het monster-raster handmatig wordt overgebracht naar een autoloader-cassette, die eveneens gekoeld is met vloeibare stikstof. De volgende stap is het plaatsen van de cassette in de TUE cryo Titan, TEM auto Loader. De TUE Cryo Titan is uitgerust met een veldemissiekanon dat werkt op 300 kilovolt.

Het vastleggen van de TAM-beelden vereist ervaring en een snelle behandeling. Dit komt doordat de elektronenbundel met hoge energie het preparaat beschadigt tijdens de beeldvorming. Leg beelden vast met een CCD-camera die is uitgerust met een energiefilter na de kolom. Aangezien gadolinium sterk paramagnetisch is en protonsignalen daardoor aanzienlijk zouden worden verbreed, is een ander schijfje gebruikt waarbij gadolinium werd vervangen door diamagnetisch yttrium en een oplossing van BT atrium.

DTPA wordt klaargemaakt. Bereken hoeveel milligram BT atrium DTPA met een molecuulgewicht van 2 979 gram per mol nodig is om een doelconcentratie van één millimolair te bereiken. Los de bepaalde hoeveelheid BT atrium DTPA vervolgens op in 50 millimolair gederectrineerde succinaatbuffer in D₂O, waarna 0,6 milliliter van de resulterende oplossing in een Wilm LABA NMR-buis wordt gepipetteerd.

Plaats het monster in een variant unity in een Nova 500 spectrometer, uitgerust met een vijf millimeter I-D-P-F-G probe van Varian. Voer de DOI-experimenten uit zoals besproken in de tekst, nadat een standaard proton-NMR is opgenomen door de 90 graden puls aan te passen en de mengtijden dienovereenkomstig te optimaliseren. De DOI one-shot pulsequentie wordt gebruikt na het bepalen van de zelfdiffusie van HDO in de referentieprobe van eierstokweefsel; in het monster wordt de diffusiecoëfficiënt van de aggregaten bepaald, waaruit de hydrodynamische straal kan worden berekend.

Bereken tot slot de hydrodynamische stralen RH van de aggregaten met behulp van de Stokes-Einstein-relatie voor de diffusie van een sferisch deeltje. Het ionische karakter van de perifere gadolinium-DTPA-complexen introduceert frustratie in de eendimensionale groei van de disco-monomeren, waarvan de kern is ontworpen om te polymeriseren tot langgerekte staafvormige aggregaten. De balans tussen attractieve en repulsieve interacties bepaalt de grootte en de vorm van de aggregaten.

Een krachtige techniek om de grootte en vorm van deeltjes en oplossingen te bepalen is een synchrotronbron. Small-angle X-ray scattering (SAXS). BTA-gadolinium-DTPA werd opgelost in een citraatbufferoplossing en de SAXS-profielen werden vastgelegd bij twee verschillende concentraties.

Een helling die in het lage Q-gebied naar nul nadert, wijst op een gebrek aan vorm en isotropie in het aggregaat, wat duidt op de aanwezigheid van bolvormige objecten. De gegevens die bij verschillende concentraties zijn gemeten, werden gefit met een homogene monodisperse sferische vormfactor, wat leidde tot een berekende straal van 3.2 nanometers. De berekende geometrische straal van monomerisch disco, BTA gadolinium DTPA is 3.0 nanometers, wat de aanwezigheid van aggregaten met een aspectratio van bijna één bevestigt om verder bewijs te leveren voor de bolvorm en nanometergrootte van de zelfgeassembleerde objecten.

Proton-diffusiegeordende NMR-spectroscopie is uitgevoerd. DOSY-NMR maakt de bepaling van de diffusiecoëfficiënten van de supramoleculaire aggregaten mogelijk, waaruit hun hydrodynamische straal kan worden berekend. De diffusiecoëfficiënt van de geaggregeerde diamagnetische dichotische amplifier in een gedeutereerde succinaatbuffer werd via de Stokes-Einstein-relatie bepaald op 0,69 × 10⁻¹⁰ m²/s.

Voor de afzonderlijke objecten met een bolvormige omvang werd een hydrodynamische straal van 2,9 nanometers berekend. Deze maat komt uitstekend overeen met de waarde die uit SOX-gegevens voor BTA gadolinium DTPA is verkregen. Verder bewijs voor een succesvolle beheersing van de eendimensionale stapellengte werd verkregen uit cryo-TEM-micrografieën.

De BTA gadolinium DTPA produceert de verwachte sferische objecten met diameters van ongeveer zes nanometer bij een concentratie van één millimolair, wat de resultaten van de so- en DOI-metingen bevestigt. De vorming van supramoleculaire polymeren in de vorm van staafjes met een hoge aspectratio is duidelijk waarneembaar in cryo-te-micrografieën bij een hoge ionsterkte. Elektrostatische afscherming is de meest waarschijnlijke verklaring voor deze bevinding.

De vorm verandert van een sferisch aggregaat van ongeveer zes nanometers in diameter naar langwerpige staafjes met een diameter van zes nanometers en een lengte tot enkele honderden nanometers. De CD-spectra bij kamertemperatuur van BTA Gadolinium DTPA bij toenemende zoutconcentratie worden hier getoond. De BTA gadolinium DTPA-concentratie is 8 × 10⁻³ millimolair bij lage ionsterkte en 4 × 10⁻³ millimolair bij hoge ionsterkte.

Hoewel er een aanzienlijk lagere concentratie wordt toegepast voor de CD-metingen, wijst het duidelijke katoeneffect op de aanwezigheid van intacte aggregaten, zelfs bij micromolaire concentraties. De vorm van het CD-spectrum verandert bij een toenemende zoutconcentratie, wat een goede indicatie is voor verminderde afstotende interacties aan de periferie van de stacks en een verbeterde pakking van de decos. Daarnaast vertonen de CD-koelingscurven van dezelfde oplossingen duidelijke verschillen in vorm.

De temperatuur waarbij aggregatie begint, verschuift naar hogere temperaturen bij een hogere zoutconcentratie. Er wordt ook een toenemend coöperatief mechanisme zichtbaar, gekenmerkt door een abruptere toename van het CD-effect, terwijl de afkoelingscurve bij nul molair natriumchloride het best beschreven kan worden door een iso-smic zelfassemblagemodel dat duidt op een anti-coöperatief proces. De afkoelingscurve bij 1,0 molair natriumchloride is typerend voor een coöperatief zelfassemblageproces en kan worden beschreven door een nucleatie-elongatiemodel dat de thermodynamische parameters van de zelfassemblage van BTA gadolinium DTPA bij nul en één molair natriumchloride kwantificeert.

Het gebruik van een coöperatief model laat duidelijk de afname van ka zien, wat de dimensieloze activeringsconstante is. Lagere waarden voor KA duiden op een hogere graad van coöperativiteit in het zelfassemblageproces, wat zich uit in de vorming van sterk verlengde supramoleculaire polymeren. Zoals waargenomen in cryo-TEM is het bij het toepassen van de gedemonstreerde experimentele technieken belangrijk om te onthouden dat alleen een combinatie van experimentele methoden zal leiden tot een betekenisvolle algemene beschrijving van de onderzochte dynamische nanomaterialen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe breed toepasbaar onze gecombineerde experimentele benadering is en hoe deze kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van zelfgeassembleerde nanomaterialen en superpolymeren.