Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en karakteriseren van T-lymfocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPS-cellen). De IPS-cellen kunnen vervolgens in vitro worden gedifferentieerd op een OP9-DL1-cultuursysteem en daarna in vivo worden gerijpt in een rag-deficiënte muis. Alternatief kunnen de cellen genetisch worden gemodificeerd om OT-1 TCR te overexpresseren en vervolgens adoptief worden overgebracht voor in vivo ontwikkeling.

Na zes weken in vivo differentiatie kunnen de muizen worden uitgedaagd door middel van intraperitoneale injectie met EEG seven-tumorcellen, waarna de antigeenspecificiteit van de uit iPS-cellen afgeleide T-cellen kan worden geëvalueerd. Uiteindelijk kunnen de iPS-cellen differentiëren tot zowel conventionele als antigeenspecifieke T-cellen, waarbij die laatste in staat zijn om dieren te beschermen tegen tumoruitdaging. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot geïndividualiseerde kankerimmunotherapie.

De methode maakt de generatie van grote aantallen tumorreactieve T-cellen mogelijk, afgeleid van een minimale hoeveelheid bloed of huidweefsel van de patiënt. Breng op dag nul 5 × 10⁴ IPS-cellen over naar een kweekschaal van 100 mm met een confluente monolaag van OP9-DL1-cellen in alpha-MEM-medium met 20% FBS. Trypsiniseer de cellen op dag vijf. Centrifugeer de cellen na incubatie op een nieuwe kweekschaal van 100 mm gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C. Plateer 5 × 10⁵ van de zwevende cellen in alpha-MEM-medium met 20% FBS en mouse fla3-ligand op een nieuwe schaal van 100 mm met een monolaag van OP9-DL1-cellen. Pipetteer op dag acht de losjes gehechte cellen voorzichtig neer, centrifugeer de cellen en breng ze vervolgens over naar één putje van een 6-well kweekplaat die is gecoat met confluente OP9-DL1-cellen. Incubeer de cellen nog twee weken bij 37 °C en 5% CO₂. Op dag 22.

Incubeer de losgekoppelde IPS-cellen in vers medium op een nieuwe kweekschaal bij 37 °C gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens ongeveer de helft van de zwevende cellen en breng deze door een nylon zeef van 70 µm om celaggregaten uit te sluiten en was de resulterende enkelcel-suspensie drie keer met koud PBS. Resuspendeer de cellen na de derde wasbeurt in PBS op een concentratie van 1,5 × 10⁷ cellen per milliliter en bewaar de cellen op ijs vóór de IV-injectie.

Plaats een vier weken oude rag-deficiënte muis onder een infraroodlamp om de staartvene te dilateren. Vul vervolgens een spuit van 1 mL, uitgerust met een naald van 26,5 gauge, met 200 µL van de celsuspensie en voer de adoptieve transfer van de cellen uit via de gedilateerde staartvene. Drie weken later, na bevestiging van de euthanasie van de muis waarin de adoptieve transfer is uitgevoerd, worden de lymfeklieren en de milt verwijderd na mechanische dissociatie van de weefsels.

Lyseer de enkelcel-suspensie met een CK-lysebuffer en was de resulterende mononucleaire cellen vervolgens tweemaal in koude PBS. Evalueer de cellen na kleuring voor celoppervlaktemarkers op dag nul via flowcytometrische analyse; gebruik op dag één het gene JAMA-transfectiereagens om geplaatste plat E-verpakkingscellen overnacht te transfecteren met een OT one MIDR. Zaai op dag twee 1×10⁶ iPS-cellen in één well van een met 0,1% gelatine voorbehandelde 24-wells plaat. Verzamel het pseudovirus-bevattende supernatant van de plat E-cellen en laat dit na centrifugatie door een 0,4 µm filter lopen om potentiële contaminanten uit te sluiten. Transduceer de cellen in aanwezigheid van polybrene gedurende één uur bij 330 ×g bij 32 °C.

Incubeer deze na herhaling van de transductieprocedure een nacht bij dezelfde temperatuur. Behandel de getransduceerde IPS-cellen op dag vier met trypsine en resuspendeer de cellen na pelletvorming in vers medium; zaai deze vervolgens uit op vooraf gecodeerde, bestraalde snl 7 6 7 feeder-cellen. Zodra de getransduceerde cellen confluentie hebben bereikt, worden de GFP- en DS-red-dubbelpositieve cellen gesorteerd middels flowcytometrie.

Zes weken na de adoptieve transfer van de IPS-cellen injecteert u 50 µL EEG-seven-thoma-cellen in de peritoneale holte van dezelfde muis op dag 50 van de tumorchallenge. Gebruik een Miltenyi Biotec CD8-positieve T-cel-isolatiekit om CD8-positieve T-cellen te sorteren uit de milt en lymfeklieren van het adoptief getransfereerde dier. Meng de geïsoleerde CD8-positieve T-cellen met bestraalde SPOC-cellen van een naïeve C57BL/6J-muis in een verhouding van 1:10 en pulseer de co-cultuur met 0,5 µmol/ml OVA gedurende 40 uur.

Voeg vervolgens felden A toe aan de cellen voor nog eens vier uur. Evalueer tot slot de celpopulaties middels flowcytometrische analyse nadat de SP-cellen zijn geïsoleerd uit een naïve C 57 black six J-muis. Verdeel de celsuspensie in twee groepen.

Label de CFSE-hoog-groep met 5 µM CFSE en pulseer de cellen gedurende één uur met 10 µg/mL ova-peptide; label de CFSE-laag-groep met 0,5 µM CFSE en pulseer deze niet. Meng 2,5 × 10⁶ CFSE-hoog-cellen met 2,5 × 10⁶ CFSE-laag-cellen in PBS. Analyseer vervolgens de cellen via flowcytometrie voor CFSE-expressie.

16 uur na adoptieve transfer in de betreffende muis. Om de intraperitoneale tumorcellen te tellen op dag 20 van de tumorchallenge. Gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een naald van 18,5 gauge en koude PBS om de peritoneale holte te spoelen. Tel de teruggewonnen tumorcellen om tumorinfiltrerende cellen te identificeren.

Verwijder de tumor in een laat stadium van de tumorchallenge en snijd de tumor vervolgens in drie stukken. Plaats het eerste tumorstuk in een cryovial en zet de vial op droogijs. Fixeer het tweede stuk onmiddellijk in formaldehyde.

Bewaar het derde deel in geconditioneerd RPMI 1640-medium nadat de cryobewaarde weefselcoupes aan de lucht zijn gedroogd. Fixeer deze gedurende 15 minuten in koud aceton nadat de gefixeerde coupes nogmaals 15 minuten aan de lucht zijn gedroogd. Was de objectglazen na de fixatie vijf minuten in PBS.

Plaats de objectglazen in een vochtige kamer en bedek de weefselcoupes gedurende 30 minuten met 30 µL van 3%B, SA en PBS om aspecifieke binding te blokkeren. Blot vervolgens de blokkeringsbuffer weg en incubeer de weefselcoupes in de vochtige kamer gedurende twee uur met een mengsel van 50 µL pe anti TCR RV alpha twee antilichaam en fitzy anti ova antilichaam, verdund in 3%PSA in PBS. Was de objectglazen na afloop van de incubatie drie keer met koud PBS en monteer de coupes tot slot met een medium op waterbasis voordat ze via fluorescentiemicroscopie worden onderzocht voor flowcytometrische analyse van tumor-infiltrerende T-cellen.

Plet de tumor tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Analyseer vervolgens de cellen op specifieke oppervlaktemarkers. CD3 en TCR beta worden gebruikt als markers voor T-cellen om te bepalen of stimulatie van iPS-cellen met het notch-ligand DL1 kon bijdragen aan T-celdifferentiatie; de expressie van CD4 en CD8 op het celoppervlak van CD3-positieve TCR beta-positieve cellen afgeleid van iPS-cellen werd beoordeeld.

Let op de dotplot aan de rechterkant, waarop dag 22 CD3-positieve TCR $\beta$-positieve CD4-negatieve CD8-positieve single-positive T-cellen worden getoond die in vitro uit iPS-cellen zijn gegenereerd. Bovendien produceerden de uit iPS-cellen afgeleide single-positive cellen uit de vorige figuur interleukine 2 en interferon gamma wanneer ze in vitro werden gestimuleerd door plaatgecoate anti-CD3 en oplosbare anti-CD28 antilichamen, wat bevestigt dat de uit iPS-cellen afgeleide T-cellen functioneel zijn na adoptieve transfer in recipientenmuizen. De meerderheid van de TCR-gentransduceerde iPS-cellen onderging differentiatie tot CD8-positieve CTL's, die in vitro reageerden op peptide-stimulatie door interleukine 2 en interferon gamma uit te scheiden in deze dotplots van gepoolde lymfeklier- en miltcellen.

CD8+ Vβ5+ T-cellen werden gegenereerd in muizen die adoptief waren overgedragen met TCR-getransduceerde, maar niet met controle-getransduceerde IPS-cellen. De CD8+ Vβ5+ populaties waren positief voor intracellulaire cytokinenkleuring voor de productie van interleukine 2 en interferon gamma, in deze histogrammen weergegeven door de donkere lijnen vergeleken met de gearceerde isotype-controlehistogrammen, wat aantoont dat de uit IPS afgeleide CTL's functioneel waren. Deze gegevens tonen CFSE-high cellen die waren gepulst met eptide, weergegeven door de pieken rechts in elke grafiek, en CFSE-low controlecellen, weergegeven door de pieken links, die waren geïnjecteerd in muizen 10 weken na IPS-celtransfer of één dag na O OT1 CTL-transfer.

De antigeenspecifieke iPS-afgeleide CTL's reageerden op antigeenstimulatie en vertoonden cytotoxische activiteit, zoals blijkt uit de afwezigheid van CFSE-high cellen hier. OT-1 TCR-gentransducerde iPS-cellen werden adoptief overgebracht naar C57BL/6-muizen, waarna de muizen werden blootgesteld aan een challenge met EGD-N tumorcellen. Op dag 20 werden de tumorcellen in de peritoneale holte geteld. Let op de significante afname van het aantal tumorcellen bij muizen die TCR-getransduceerde iPS-cellen ontvingen in vergelijking met de controlegroepen.

Het belangrijkste is dat adoptieve transfer van TCR-getransduceerde iPS-cellen infiltratie van overreactieve CTL's in tumorweefsels triggerde en dieren beschermde tegen tumorchallenge, zoals te zien is in deze H&E-kleuring van tumorweefsels die 30 tot 35 dagen na de tumorchallenge zijn verkregen; tumoren van muizen die adoptief waren overgebracht met TCR-getransduceerde cellen of OT-1 CTL's, maar niet van de mock-geïnjecteerde of controlegroep. Getransduceerde cellen waren geïnfiltreerd door inflammatoire cellen, zoals aangegeven door de rode pijlen hier. Ova-specifieke Vα2-positieve CTL's in het rood infiltreerden ova-exprimerende tumorweefsels in het groen.

Hoewel tumoren bij muizen uit de controlegroepen in deze figuur minder of geen tumorinfiltrerende cellen vertoonden, werden enkelcel-suspensies van tumorweefsels geanalyseerd op expressie van V alpha twee positiviteit en V beta vijf positiviteit via flowcytometrie na gating op de CD acht positieve populatie. Merk op dat tumorweefsels van muizen waaraan TCR-getransduceerde IPS-cellen adoptief waren overgebracht, het hoogste niveau van tumorinfiltrerende cellen vertoonden, terwijl tumoren van muizen die controle-getransduceerde IPS ontvingen, geen infiltratie vertoonden door ova-specifieke CD acht positieve T-cellen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe antigeenspecifieke T-cellen uit IPS-cellen kunnen worden gegenereerd en hoe de functies van de uit IPS afgeleide T-cellen kunnen worden geëvalueerd.