Visualisatie en analyse van de bloedstroom en zuurstofverbruik in de lever microcirculatie: Toepassing op een acute hepatitis Model

Er is een optisch systeem ontwikkeld om de hepatische microcirculatie te visualiseren met fluorescentielabelled erytrocyten en om de zuurstofpartiële druk in de microvaten te meten met laser-ondersteunde fosfo-beeldvorming. Deze methode kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen te onderzoeken door de microvasculaire structuur, diameter, bloedstroomsnelheid en zuurstofspanning te analyseren. In de hepatische microcirculatie stroomt het bloed van de portale ES naar de centrale Es, waardoor er een zuurstofgradiënt tussen beide ontstaat.

De zuurstofconcentratie in de lever beïnvloedt zowel de enzymexpressie als de pathologie, waardoor bloedstroomanalyse en zuurstofmeting belangrijke onderzoeksonderwerpen zijn. Onze experimentele methode omvat het intraveneus toedienen van met fluorescentie gelabelde rode bloedcellen.

Om de microcirculatie te visualiseren met fluorescentie voor de meting van de zuurstofpartiële druk, dienen we palladiumporfyrine intraveneus toe, dat in de bloedbaan fosforesceert wanneer het door een laser wordt geëxciteerd, waarbij de mate van emissie afhankelijk is van de concentratie van de omringende zuurstof. Dit proces maakt een kwantitatieve analyse van zuurstof mogelijk; de meting van de partiële druk in de hepatische microcirculatie toonde een partiële zuurstofdruk in de portaal- en centrale venen van respectievelijk 59,8 en 38,9 millimeters kwik, wat een effectieve meting van de zuurstofconcentratie aantoont. Vervolgens hebben we deze methodologie toegepast op een hepatitismodel.

We stelden een verhoogde zuurstofpartiële druk vast in de portale ES sinusïden en centrale es, maar een verlaagd drukverschil tussen de portale en centrale es. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een verminderd zuurstofverbruik in het centrale Ven-gebied als gevolg van hepatocytennecrose. Deze resultaten tonen aan dat onze methodologie, waarbij een optisch systeem wordt gebruikt om de hepatische hemodynamiek en het zuurstofverbruik te meten, in staat is om mechanismen van diverse leverziekten in de hepatische microcirculatie te verhelderen.

De zuurstofgradiënt is een essentiële parameter die verband houdt met de expressie van enzymen in periportale en paracentrale regio's, en met verschillende soorten leveraandoeningen die gerelateerd zijn aan microdistributies, waardoor het kwantificeren van de bloedstroom en het zuurstofverbruik van groot belang is. Om de mechanismen te verduidelijken, is het voordeel van onze methode dat een contactloze en continue optische meting de bloedstroom, de diameter van de bloedvaten en de zuurstofgradiënt in de hepatische microcirculatie kan kwantificeren. Volbloed werd afgenomen van een donormuis en de erytrocyten werden tweemaal gewassen met PBS door centrifugatie bij 400 G gedurende vijf minuten.

Los vervolgens twee milligram FITC op in één milliliter 100 millimolair DI natriumwaterstoffosfaat voordat het door een membraan met een poriegrootte van 0,2 micron wordt gefiltreerd. Plaats daarna één milliliter FITC-oplossing in een reageerbuis samen met 0,15 milliliter drie millimolaire dextran-oplossing, 0,25 milliliter 180 millimolair DI natriumwaterstoffosfaat en 1,5 milliliter 100 millimolair DI natriumwaterstoffosfaat en tik de buis aan om te mengen. Bewaar dit twee uur bij kamertemperatuur voordat de gekleurde RBC's tweemaal met PBS worden gewassen.

Plaats vervolgens een kleine hoeveelheid RBC-suspensie op een objectglas en bevestig zowel het normale uiterlijk van de RBC's als voldoende fluorescentie. Suspendeer 0,1 milliliter RBC's in 0,9 milliliter PBS en bewaar dit bij vier graden Celsius tot gebruik. Los daarna 500 milligram BSA op in 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens 30 milligram palladiumporfyrine toe en schud dit gedurende de nacht. Centrifugeer de oplossing om eventuele onopgeloste palladiumporfyrine te verwijderen en filtreer het supernatant door een 0,2 micron po-membraan. Aliquoteer één milliliter filtraat in reageerbuisjes en bewaar deze bij minus 20 graden Celsius. Zorg ervoor dat herhaaldelijk invriezen en ontdooien wordt vermeden.

Om de microcirculatie microscopisch te visualiseren, snijdt u een gat van 20 millimeter diameter in een plastic plaat en bedekt u het gat met een vierkant dekglas van 30 millimeter per zijde. Spreid de hoofdleverkwab in buikligging uit op een plastic plaat nadat een staartvene is gecannuleerd. Gebruik vervolgens meerdere stukken plastic vershoudfolie van drie millimeter bij acht millimeter om het gebied rondom de kwab af te dekken, zodat beweging door ademhaling en uitdroging worden voorkomen.

Visualiseer de hepatische circulatie met een transmissiemicroscoop en bevestig dat er gedurende ten minste 15 minuten geen stase van de bloedstroom in het gezichtsveld optreedt. Injecteer geleidelijk 0,2 mL fluorescent gelabelde RBC's om de bloedstroom waar te nemen.

Om de zuurstofpartiële druk te meten, injecteert u 0,2 milliliters palladiumporfyrine-oplossing. FITC-gelabelde RBC's zullen één vijftigste van alle circulerende RBC's in het gevisualiseerde gebied vormen; exciteer de FITC door deze te bestralen met een kwiklamp waarvan het licht door een banddoorlaatfilter van 450 tot 490 nanometer gaat en registreer de fluorescentie met een CCD-camera. De fosforescentie van palladiumporfyrine is relatief zwak en vereist een detector met een hoge gevoeligheid en een verduisterde kamer.

De absorptiepieken van palladiumporfyrine liggen rond 410 en 532 nanometer, waarbij de tweede harmonische golflengte van 532 nanometer wordt aanbevolen. Deze golflengte wordt gegenereerd door een neodymium-YAG-pulslaser; verbind de laserstraal met een omgekeerde microscoop en stel deze zo in dat de straal het centrum van het brandvlak belicht. De ruimtelijke resolutie van de laser is afhankelijk van de spotgrootte, die kan worden aangepast door de straal door een pinhole te leiden.

Bevestig ook een long-pass filter en een fotomultiplicatierbuis aan de microscoop om fosforescentie te detecteren. De PMT moet gevoelig zijn voor rode golflengten, in het bijzonder rond de 700 nanometer. Meet het fosforescentiesignaal en bereken de vervaltijdconstante door een exponentiële functie toe te passen.

In dit experiment hebben we 500 punten bemonsterd bij 200 kilohertz. Bereid ter kalibratie twee palladiumporfyrine-oplossingen voor met een zuurstofpartiële druk van respectievelijk 150 en nul millimeter kwik. Voeg aan de oplossing van nul millimeter kwik 1% dihi-natrium toe aan de monsters om de conditie te creëren waarin zuurstof afwezig is tijdens de kalibratie.

Houd de pH van het monster op 7,4 en de temperatuur op 37 °C. Plaats de muis op de microscooptafel en positioneer de microvaten waarvan u de hepatische microcirculatie wilt visualiseren in het laserpunt. Geef jonge muizen 's nachts vrije toegang tot water; injecteer acetaminophen in een dosis van 200 mg/kg intraperitoneaal. Anestheseer de muis 24 uur na de injectie en leg de lever vrij met een mediane incisie. Indien er sprake is van hepatitis, zal dit met het blote oog gemakkelijk zichtbaar zijn door necrose in de paracentrale regio.

Onze meting van de partiële zuurstofspanning en de hepatische microvaten bij muizen toonde gemiddelde zuurstofspanningen van respectievelijk 59,8, 48,2 en 38,9 millimeters kwik voor de portaalvenen, sinusoïden en centrale venen. Met andere woorden geeft de zuurstofgradiënt van de portaalvenen naar de centrale venen aan dat er voldoende zuurstof vrijkomt uit de RBC's terwijl deze door de sinusoïden stromen. We hebben muizen met door acetaminophen geïnduceerde hepatitis klaargemaakt om de hepatische microvaten te meten.

Als voorbeeld van een pathologiemodel stelden we vast dat de zuurstofpartiële drukken in de poortaders, sinusoïden en centrale venen hoger waren in de acetaminophen-groep vergeleken met normale muizen. Het verschil in zuurstofpartiële druk tussen de poortaders en centrale venen was 20.9 millimeters of mercury voor normale muizen en 16.9 millimeters of mercury voor de muizen in het hepatitismodel. Het verschil in zuurstofpartiële druk tussen de poortaders en centrale venen was 20.9 millimeters of mercury voor normale muizen en 16.9 millimeters of mercury voor de muizen in het hepatitismodel.

De zuurstofgradiënt in de hepatische microcirculatie ontstaat hoofdzakelijk door de toevoer van zuurstof vanuit de poortader die wordt verbruikt door hepatocyten; hepatocytennecrose in het centrale veneuze gebied veroorzaakt door acetaminophen leidt tot een verminderd zuurstofverbruik, een beïnvloeding van de stroomafwaartse microcirculatie en bijgevolg tot problemen gerelateerd aan de hemodynamiek. Zuurstoftoevoer en zuurstofverbruik zijn betrokken bij veel vormen van leverziekten. Wij hebben een model voor acute hepatitis ontwikkeld en een toename van de zuurstofspanning in de microvaten vastgesteld.

Ons optische systeem kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen te onderzoeken door de microvasculaire structuur, de stroomverdeling en het zuurstofverbruik te analyseren.