Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een populatie gezonde stamcellen naast weefsel te positioneren waarin stamcellen zijn geablateerd binnen een parian, om zo het gedrag van stamcellen en hun nakomelingen in vivo tijdens regeneratie te analyseren. Dit wordt bereikt door een niet-bestraalde of een Leafly-bestraalde parian te anesthetiseren en te immobiliseren voor verdere manipulatie. Vervolgens wordt de geïmmobiliseerde, niet-bestraalde parian gedeeltelijk afgeschermd met lood en daarna röntgenbestraald, wat resulteert in een onbeschadigde parian met weefsel waarin stamcellen zijn geablateerd, direct naast het afgeschermde weefsel dat nog steeds stamcellen bevat.

Als alternatief kan een weefseltransplantaat van een niet-bestraalde donor worden getransplanteerd in een eerder bestraalde gastheer om een parian te produceren met een geïsoleerde populatie stamcellen. De resultaten van een anderszins stamcel-geablateerde gastheer tonen geïsoleerde stamcelpopulaties aan naast de stamcel-geablateerde weefsels via whole mount RNA in situ hybridisatie voor stamcelmarkergenen.

De hier beschreven methoden zijn erop gericht om de regeneratie van planaria beter te begrijpen door het gedrag van stamcellen te bestuderen in zowel een transplantatieparadigma als een paradigma van partiële bestraling; hiermee kan worden getest of de omringende weefsels en de lokale omgevingen waarin deze stamcellen zich bevinden, het gedrag van deze neoblasten of stamcellen beïnvloeden. Tijdens het regeneratieproces, één tot twee maanden vóór het experiment, worden de planaria gevoed volgens het bijbehorende manuscript. Om de gewenste grootte voor deze demonstratie te verkrijgen, worden planaria geselecteerd met een lengte tussen één en twee centimeter en een breedte van meer dan twee millimeter.

Vervolgens worden ze drie tot zeven dagen voor gebruik vastgezet. Bereid daarna de Chlorotoon-oplossing voor, een mild lokaal anestheticum, door 0,1 tot 0,2% gewicht per volume cleone op te lossen in parian-water. Koel de oplossing daarna op ijs voor weefseltransplantatie; buig met een bunsenbrander een capillaire buis met een binnendiameter van 0,75 millimeter op één tot twee centimeter van het uiteinde in een hoek van 90 graden om het graft-weefsel door te snijden.

Buig vervolgens een andere capillaire buis met een buiten diameter van 0,7 millimeter op één tot twee centimeter van het uiteinde in een hoek van 90 graden om een gat in de gastheer te maken voor het transplantaat. Snijd daarna het zwarte Whatman nummer 3 filterpapier, Kimwipe-filterpapier en sigarettenrolpapier volgens de maten die in het bijbehorende manuscript zijn aangegeven.

Bereid daarna de gemodificeerde Holt Fers-oplossing en de verzadigde Caine Holt Fretter-oplossing. Koel beide oplossingen af tot vier graden Celsius. Bevestig vervolgens een gevouwen Kim wipe aan een vierkant stuk Paraform.

Plaats het op de Peltier-koelplaat of een ander koelapparaat onder een dissectiemicroscoop. Verzadig vervolgens het Kim wipe met gekoelde Holt Fretter-oplossing. Plaats daarna twee rechthoekjes zwart filterpapier op het Kim wipe.

Plaats nu een stuk Watman nummer twee filterpapier in een Petrischaal. Bevochtig het filterpapier met Holt Fretter-oplossing. Koel de schaal vervolgens op ijs voor gedeeltelijke bestraling.

Plaats een grotere papieren voering in een grotere schaal, vergelijkbaar met weefseltransplantatie. Bevochtig het filterpapier met Holt Fretter-oplossing. Koel de schaal vervolgens af op ijs.

Vul bij deze procedure een petrischaal met gekoelde cleone-oplossing. Pipetteer de Planaria in de schaal voor transplantatie. Anestheseer slechts één gastheer en één donor tegelijk.

Voor gedeeltelijke bestraling kunnen veel dieren tegelijk worden geanestheseerd. Laat de paria vervolgens vijf tot 10 minuten weken in de cleone-oplossing tot ze bewegingloos worden. Spoel de paria door ze met een pipet in een schaal met gekoelde Holt Fretter-oplossing over te brengen.

Immobiliseer daarna het plin-gebied door deze te pipetteren op zwarte filterpapieren die verzadigd zijn met gekoelde Holt-fretter-oplossing. Richt ze vervolgens met een pincet met de ventrale zijde naar beneden. Plaats nu een eerder in een ijsemmer voorbereide gekoelde Petrischaal die in een top-source röntgenbestraler past.

Schik het gebied met de genarceerde planaria in een Petrischaal door de zwarte filterpapieren te verschuiven. Plaats ze vervolgens in de bovenste röntgenbestralingsbron en positioneer de ijsemmer zodanig dat de afstand van de kathodebuis tot de planaria wordt geminimaliseerd. Hiermee wordt de effectieve dosisratio gemaximaliseerd.

Plaats vervolgens de loden afschermingen tussen de paria en de kathodebuis voor de röntgendosis. Indien volledige stamcelablatie in de niet-afgeschermde regio's gewenst is, dient een dosis van 30 grays of meer te worden toegediend. Verplaats de paria direct na de röntgenemissie naar gekoeld paria-water.

Laat daarna het pariaanse water opwarmen tot kamertemperatuur en laat de dieren zichzelf losmaken van het zwarte filterpapier. De procedure voor gedeeltelijke bestraling is nu voltooid. Om deze procedure onder de dissectiemicroscoop te starten, plaatst u de geanestheseerde gastheer en donor op afzonderlijke rechthoekige zwarte filters op de Kim wipe, die reeds is afgekoeld op de Peltier-element of koelplaat.

Gebruik een capillaire buis met een binnendiameter van 0,75 millimeter om de graftplug uit de donor te snijden. Gebruik vervolgens een pincet om deze op een ongestoord deel van de gastheer te plaatsen. Gebruik daarna een capillaire buis met een buitendiameter van 0,7 millimeter om een plug uit de gastheer te verwijderen.

Plaats vervolgens het transplantaat in het gat. Verplaats de getransplanteerde gastheer op het rechthoekige zwarte filterpapier naar de eerder voorbereide Petrischaal. Bevochtig een stukje sigarettenpapier met een met Caine verzadigde Holt Fretter-oplossing.

Plaats dit vervolgens bovenop de getransplanteerde gastheer. Week daarna vier stukjes filterpapier die verzadigde Holter-oplossing bevatten, en indien de getransplanteerde gastheer onderdompelt, week vervolgens vier plukjes gesneden Kimwipe die verzadigde Holt Fretter-oplossing bevatten. Leg deze over de filterpapieren heen.

Sluit daarna het deksel. Plaats de Petri-schaal op ijs. Breng vervolgens de donor-parian over naar het parian-water voor herstel en regeneratie.

Wanneer alle transplantaties zijn voltooid, plaatst u de getransplanteerde parian gedurende de nacht in een incubator van 10 °C. Verplaats deze de volgende ochtend naar een Petrischaal gevuld met parianwater. Laat de parian zich ofwel zelf losmaken van het filterpapier, of verwijder deze voorzichtig met een pincet en verschoon het parianwater daarna eens in de twee tot drie dagen.

Hole mount in situ hybridisatie in de bestraalde, maar volledig afgeschermde controle-parian, gefixeerd drie dagen na bestraling, laat een stamceldistributie zien die niet te onderscheiden is van die van de wild-type parian. Enerzijds is bij de parian die slechts gedeeltelijk was afgeschermd, waarbij de anterieure en posterieure delen waren blootgesteld, te zien dat stamcellen uit de niet-afgeschermde regio's lijken te zijn geablateerd. Hier worden de dorsale en ventrale aanzichten van een succesvol getransplanteerde parian getoond.

Drie dagen na de transplantatie is het transplantaat duidelijk zichtbaar op zowel het dorsale als het ventrale oppervlak en wordt het omringd door karakteristiek ongepigmenteerd weefsel bij de interface tussen transplantaat en gastheer. Echter, bij een mislukte transplantatie is er geen zichtbaar transplantaatweefsel aanwezig op de transplantatieplaats. Whole mount in situ hybridisatie onthulde de aanwezigheid van stamcellen uitsluitend in of rond de locatie van het transplantaat, wat na goede beheersing van de methode het succes van de transplantatie aangeeft.

Transplantaties kunnen elk in slechts vijf minuten worden uitgevoerd. Met succespercentages die 90 tot 100% benaderen, kan gedeeltelijke bestraling sterk worden opgeschaald, mits de veldgrootte van uw bestralingsapparaat voldoende groot is.