Voorbereiden van T-cel groeifactor van Rat Splenocyten

Hallo, ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het laboratorium van George Chen bij de afdeling Fysiologie en Biofysica van de University of California in Irvine. In de komende twee dagen ga ik u laten zien hoe u TCGF bereidt, wat staat voor T-celgroeifactor.

Voor onze dagelijkse celkweek, wanneer we geen precieze kennis nodig hebben van de samenstelling van de cytokinen in het kweekmedium, gebruiken we T-celgroeifactor (TCGF). Dit is het supernatant van een miltcelkweek die de benodigde cytokinen bevat om de T-cellen te helpen expanderen. De manier waarop we TCGF bereiden, is door de milten te nemen van gezonde Lewis-ratten nadat deze zijn gedood, een suspensie van enkelvoudige cellen voor te bereiden, de rode bloedcellen te verwijderen door middel van lyse, en vervolgens de mononucleaire cellen te stimuleren met concanavaline A, wat de T-cellen induceert om alle benodigde cytokinen voor hun groei te produceren. Om de TCGF te genereren, moeten we de cellen activeren.

De methode die we gebruiken is dat we lectine ConA (afgekort als ConA) toevoegen aan onze celcultuur. Wanneer we ConA toevoegen aan de celcultuur, bindt dit aan het glycosyleerde T-celreceptorcomplex. Door gelijktijdig aan meerdere complexen te binden, vindt er een proces plaats dat we capping noemen. Hierbij aggregeren de receptoren aan het celoppervlak tot clusters, wat een activatiesignaal in de T-lymfocyten induceert.

Nadat de cellen zijn geactiveerd, zullen ze gaan prolifereren. Ze zullen in omvang toenemen en vervolgens cytokines gaan uitscheiden. Oorspronkelijk dachten we dat TCGF voornamelijk bestond uit interleukine 2, maar we weten nu dat dit niet echt het geval is.

Het bevat ook interferon gamma, TNF alfa en waarschijnlijk ook cytokinen in zeer kleine hoeveelheden die net nodig zijn om de cellen na 48 uur in kweek in leven te houden. De cellen hebben alle cytokinen geproduceerd die we nodig hebben. Daarom gaan we de cellen verwijderen, en wanneer we de cellen hebben verwijderd en alleen het supernatant overhouden, bevindt er zich nog steeds wat vrij conal in het supernatant. Dat gaat een probleem vormen, omdat we onze T-celgroeifactor echt willen gebruiken om T-cellijnen te laten groeien.

En als we de ConA vrij laten, zullen de cellen worden geactiveerd op momenten dat we dat niet willen. Om dat probleem op te lossen, voegen we een overschot aan een suiker toe die zal binden aan alle vrije ConA in het concentraat. Hierdoor wordt het volledig geïnactiveerd en zal het niet binden aan andere glycosylereceptoren op de cellen wanneer we de TCGF aan de cultuur toevoegen.

Laten we beginnen. De eerste stap van dit experiment is het verwijderen van de milt uit de rat direct na euthanasie. Dat is wat ik nu ga doen met behulp van steriele instrumenten.

Zodra ik de milten heb verwijderd, plaats ik ze in PBS aangevuld met antibiotica; als antibiotica gebruik ik penicilline en streptomycine. Laten we beginnen. Ik spray de rat in met 70% ethanol om er zeker van te zijn dat er geen contaminatie van mijn cultuur optreedt.

Vervolgens maak ik met mijn instrumenten een kleine incisie in de huid. Daarna verwijder ik een laag spierweefsel en komt de milt hier tevoorschijn. Met een andere pincet trek ik de milt voorzichtig naar buiten zonder deze te beschadigen.

Ik verwijder het bindweefsel op deze manier. Nu heb ik een milt. Natuurlijk ben ik zeer voorzichtig om niets anders in de buikholte te beschadigen, omdat elke beschadiging aan de darm zal leiden tot onmiddellijke contaminatie van mijn milt.

Vervolgens breng ik mijn milt over naar een buis met PBS en antibiotica. Deze buis bewaar ik op ijs. Ik heb nu de milten van drie ratten geoogst.

We zijn nu klaar om een enkelcellige suspensie te bereiden uit deze milten. Nu ik de milten heb, breng ik ze naar een weefselkweekkast om er met behulp van 70 micron cellstrainers een enkelcellige suspensie van te maken. Ik heb verschillende benodigdheden nodig om de enkelcellige suspensie uit de milten te bereiden.

Ik heb steriele instrumenten nodig, één pincet en één schaar. Daarnaast heb ik de zuiger van een steriele spuit van 1 mL in de petrischaal. Ik ga mijn milten in PBS met antibiotica plaatsen.

En in een andere Petrischaal heb ik een cellzeef van 70 micron geplaatst in 10 milliliter PBS plus antibiotica. De eerste stap is om er zeker van te zijn dat de milten schoon zijn, want zoals u hier kunt zien, zitten er nog kleine stukjes bindweefsel en deze ga ik verwijderen omdat ze de cellzeef erg snel zullen verstoppen. Hiervoor snijd ik simpelweg weg wat ik niet wil hebben en gooi ik dit in het deksel van de Petrischaal.

Mijn milten zijn nu grotendeels schoon, dus ik zal de milten één voor één nemen, ze in de cell strainer plaatsen en in kleine stukjes snijden. Vervolgens meng ik alle drie de milten. De volgende stap is het maken van een single-cell suspensie. Omdat ik alles steriel wil houden, raak ik de cell strainer niet aan en gebruik ik de zuiger van een steriele spuit van 1 ml om de stukjes milt door de cell strainer te drukken.

En zoals u kunt zien aan de buitenkant van de cell trainer, wordt er een suspensie van enkelvoudige cellen gemaakt. Bij de eerste ronde zitten er nog enkele kleine stukjes milt in, maar ik zal de suspensie van enkelvoudige cellen nu al gaan opvangen. Ik heb deze al overgebracht naar een buis van 50 ml die ik op ijs heb bewaard.

Vervolgens vul ik mijn celzeef aan met nog 10 mL PBS met antibiotica. Ik neem dus ongeveer 10 mL PBS met antibiotica; dit hoeft niet zeer nauwkeurig 10 mL te zijn, aangezien we enkel aan het wassen zijn. Ik voeg dit toe aan de celzeef en volg daarna dezelfde procedure.

Ik ga terug naar de zuiger van mijn spuit en druk nog iets meer van de milt door. Natuurlijk zul je nooit alles erdoor krijgen, omdat er bindweefsel en kleine stukjes vet zijn die ik niet kon verwijderen en die in de celzeef zullen blijven zitten. Maar het grootste deel van de milt zou door de celzeef moeten gaan.

Vervolgens herhaal ik precies wat ik eerder heb gedaan. Ik ga mijn enkelcel-suspensie oogsten en deze aan dezelfde tand toevoegen. Tegen deze tijd is er bijna niets meer van het scherm in de celzeef achtergebleven en de PBS die eruit komt is veel helderder. Ik ga simpelweg nogmaals wassen en tegen die tijd zouden de meeste cellen eruit moeten zijn.

Nu ik mijn enkelcel-suspensie van PLE-cyten heb, ga ik deze centrifugeren om ze simpelweg te pelletten. Centrifugeren gedurende 8 tot 10 minuten is hiervoor voldoende. We hebben de PLE-cyten nu gecentrifugeerd en er is een mooie pellet ontstaan.

Ik ga nu het supernatant verwijderen en vervolgens de rode bloedcellen lyseren. Hiervoor suspendeer ik de myocyten in ammoniumchloride. Ik gebruik hiervoor een oplossing van 0,15 M ammoniumchloride, met een volume van 5 mL per milt.

Aangezien ik drie milten had, gebruik ik 15 milliliter ammoniumchloride en doe ik dit op ijs. Om de erytrocyten te lyseren, pipetteer ik het mengsel drie minuten lang voorzichtig op en neer. Oké, we gebruiken dit shot met de hogere belichting hier.

Ik heb de elektrocyten nu drie minuten geanalyseerd. Ik ga mijn buis vullen met PBS, of u kunt ook medium gebruiken. Dit is om de osmolariteit van de oplossing terug te brengen naar het normale bereik voor de cellen.

Vervolgens centrifugeer ik de cellen, zoals eerder gedaan, gedurende 8 tot 10 minuten om ze tot een pellet te brengen. Daarna was ik ze twee keer met dezelfde PBS met antibiotica. We centrifugeren nu de cellen na het lyseren van de elektrolyten; maak u geen zorgen, we krijgen nooit een honderds procentige vrijgave van de elektrolyten.

Het pellet zal nog steeds rood zijn, maar het supernatant zal helderder zijn. Nu ga ik het supernatant afgieten, het pellet resuspenderen, PBS toevoegen tot 50 ml, centrifugeren en deze stap nogmaals herhalen zodat ik twee wasbeurten heb. Daarna kan ik ze tellen. Ik heb de myocyten twee keer gewassen, ze vervolgens gesuspendeerd in kweekmedium en ze geteld met een cytometer.

Zoals verwacht. Uit drie milten heb ik ongeveer 600 miljoen cellen verkregen, wat verwacht wordt aangezien één milt normaal gesproken 200 tot 250 miljoen cellen oplevert. Wat ik nu ga doen, is de cellen zaaien met een dichtheid van 2 miljoen per ml in mijn medium dat is aangevuld met 10% foetaal kalfserum.

Aan dat medium voeg ik 2 µg/mL Concanavaline A toe om de cellen te stimuleren. Daarna plaats ik de cellen simpelweg gedurende 48 uur in de incubator. De cellen hebben nu 48 uur in de incubator gestaan en, zoals ik zal laten zien, zijn ze goed gegroeid.

Het medium is oranje geworden. We zijn nu klaar om onze voorbereiding voor de TCGF af te ronden. Zoals u zult weten, heb ik con carnaval toegevoegd aan mijn celsuspensie om de cellen te activeren.

De Concanavaline A is een lectine. Deze zal binden aan de suikers op alle receptoren van de T-cel en al deze cellen kunstmatig activeren. Het probleem waar we nu voor staan, is dat er nog steeds Concanavaline A aanwezig is in het supernatant van de cellen.

En aangezien we concanavaline A in andere T-celculturen zullen gebruiken om de cellen uit te breiden, willen we niet dat er concanavaline A aanwezig is in die celculturen. Om dit te verwijderen, ga ik een overmaat aan suiker toevoegen waaraan concanavaline A bindt, namelijk methyl alpha D-glucoside, hier getoond. Ik zal een overmaat van deze suiker toevoegen en deze volledig oplossen.

Het zal al het resterende conc naval binden en zodra dat is voltooid, ga ik mijn celsupernatanten steriel filteren en ga ik aliquoten invriezen voor gebruik in de komende weken of maanden. Laten we beginnen met deze laatste stap. Ik voeg mijn celkweeksupernatant toe aan 50 ml buisjes om ze te kunnen centrifugeren om de cellen te verwijderen.

Ik vul dus simpelweg zoveel buisjes als nodig is. Dat doe ik niet in de steriele werkbank; dat zou kunnen, maar aangezien ik mijn oplossing aan het einde sowieso moet filteren omdat ik suiker toevoeg die niet steriel is, doe ik dit gewoon op de werkbank. Dat is makkelijker. Ik heb nu al mijn cellen en supernatant in mijn 50 ml falcon-buisjes gegoten.

Ik zal ze nu in de centrifuge plaatsen en ongeveer 10 minuten centrifugeren. Het enige doel van het centrifugeren is om de cellen te pelletteren, zodat ik heldere supernatanten krijg. De cellen zijn nu neergeslagen, waardoor de supernatant helder is en dit is wat ik wilde verzamelen.

Ik verzamel alle supernatant in een schone fles van 150 vierkante centimeter. Aan deze fles voeg ik de suiker toe. Terwijl de cellen centrifugeerden, heb ik voldoende suiker afgewogen om een concentratie van 15 milligram per ml supernatant toe te voegen.

Ik laat het volledig oplossen en daarna filter ik mijn supernatant steriel. Nu voeg ik de suiker toe, 15 milligram per ml supernatant. Ik plaats de dop terug en aangezien ik niet onder steriele omstandigheden werk, maakt het niet uit of er wat in de dop komt, dus ik meng tot alle suiker is opgelost.

Dat zou vrij snel moeten gaan. Ja, alle suiker is nu opgelost. Dus het enige wat ik nog moet doen is het supernatant steriel filteren en het vervolgens in aliquoten verdelen.

Normaal gesproken maak ik aliquots van 10 tot 15 µL die ik bewaar bij -20 °C. Aliquots zoals deze kunnen meerdere maanden bewaard worden. U kunt uw TCGF ook in de koelkast bewaren, maar dan zou ik het binnen de komende 10 tot 15 dagen gebruiken.

In de afgelopen twee dagen heb ik u laten zien hoe u T-celgroeifactor bereidt; dit supernatant is zeer eenvoudig te maken en zeer goedkoop om voor te bereiden. Daarom gebruiken we het zeer vaak in het laboratorium om onze T-cellijnen in cultuur te houden zonder dat we dure cocktails van cytokines hoeven te kopen. Veel succes met uw experimenten.