Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Lyco negatieve streng, RNA-virussen. Het genoom van influenzavirussen wordt verpakt in de vorm van virale ribonucleoproteïnecomplexen, of vRNP's, waarin het enkelstrengs genoom is ingekapseld door het nucleoproteïne en geassocieerd is met het polymerasecomplex bestaande uit de PA-, PB1- en PB2-subunits. Om intacte complexen uit geïnfecteerde zoogdiercellen te zuiveren, worden HeLa-cellen geïncubeerd met recombinant strept-tagged influenzavirus.

Zodra het virus de cellen binnendringt, wordt het virale RNA na infectie in de kernen gesynthetiseerd; de cellen worden vervolgens gelyseerd met behulp van een detergent en gefractioneerd in cytoplasmatische, nucleaire en chromatinefracties via centrifugatie en een protocol voor chromatinefractionering op basis van zoutconcentraties. Ten slotte worden de strept-tagged VRP's uit elke fractie geaffineerd. Analyse van de eiwit- en RNA-samenstelling van de gezuiverde VRNP's via zilverkleuring demonstreert dat met dit protocol zelfs sterk aan chromatine gebonden VRP's intact kunnen worden geïsoleerd. Een van de belangrijkste voordelen van ons protocol vergeleken met standaardmethoden voor de affiniteitszuivering van ribonucleoproteïnecomplexen van het influenzavirus is dat het met onze methode mogelijk is om VRNP's te zuiveren uit het chromatine van geïnfecteerde cellen, wat bekend staat als de locatie van de synthese van influenzavirus-mRNA.

Onze methode kan dus worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de regulatie van virale replicatie en transcriptie, zoals bijvoorbeeld welke virale of cellulaire factoren, maar ook welke posttranslationele modificaties vereist zijn voor bijvoorbeeld virale mRNA-synthese of virale genomische RNA-synthese. Onderzoekers die nieuw zijn met deze methode kunnen mogelijk tegen problemen aanlopen, omdat subnucleaire fractionering zeer gevoelig is voor biochemische condities en bovendien sterk kan variëren tussen verschillende cellijnen. Begin dit protocol met cellen die zijn geïnfecteerd met het influenzavirus RWSN PB2-strep, waarbij een strep-tag genetisch is gefuseerd aan de C-terminus van de PB2-subeenheid bij een multiplicity of infection van 3.

Was de cellen één keer met koud PBS, voeg vervolgens 12 milliliter koud PBS toe en verwijder ze uit de schaal met behulp van een rubberen schraper. Breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter en pelletteer ze door middel van centrifugatie.

Het moeilijkste aspect van deze procedure is het protocol voor cel-fractionering. Celkernen zijn zeer gevoelig voor homogenisatie- en mengprocedures; als deze onjuist worden uitgevoerd, kan dit een chromatine-extract gemakkelijk verpesten. Daarom is het zeer belangrijk om niet alleen de homogenisatietechnieken te volgen, maar ook de algemene behandeling van lysaten zoals we hier laten zien.

Na het centrifugeren van het aspiraat, de PBS en de Resus, wordt het celpellet gesuspendeerd in 10 milliliters koude sucrosebuffer. Bevestig een 200 microliter pipettepunt aan een 10 milliliter plastic serumpipet en leid de cellen hierdoorheen om celklonters op te breken. Incubeer de suspensie gedurende 10 minuten op ijs.

Keer de cellen periodiek voorzichtig om om ze opnieuw te suspenderen. Voeg vervolgens non IET P 40 toe tot een eindconcentratie van 0.5% en vortex met hoge snelheid gedurende 15 seconden; centrifugeer onmiddellijk gedurende 10 minuten bij 3, 500 ×g bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en breng dit over naar een conische buis van 15 milliliter.

Bewaar het supernatant bij vier graden Celsius. Dit is een cytoplasmatische fractie. De pellet moet kleiner en witter zijn dan de oorspronkelijke celpellet, zoals hier wordt getoond.

Als het protocol op een later tijdstip wordt voltooid, bewaar het celpellet dan bij vier graden Celsius. Ga anders verder door het pellet te wassen in 5 ml koude sucrosebuffer en opnieuw te centrifugeren zoals voorheen. Zodra het centrifugeren is voltooid, gooi dan het supernatant weg en resuspendeer het pellet, dat de kernen bevat, in 1,5 ml koude nucleoplasmische extractiebuffer.

Breng het geresuspendeerde pellet over naar een gekoelde, volledig glazen homogenisator van vier milliliter met een nauwsluitende stamper en homogeniseer de kernen met 20 slagen. De weerstand zou na ongeveer 10 slagen moeten toenemen; voorkom hierbij schuimvorming. Controleer het monster onder een fasecontrastmicroscoop om een efficiënte homogenisatie te bevestigen.

De kernen mogen niet langer rond zijn, maar moeten onregelmatige vormen hebben en eruitzien alsof ze zijn opengebarsten. Zodra de kernen zijn gehomogeniseerd, brengt u deze over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Incubeer het homogenisaat op een draaiend wiel bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Centrifugeer vervolgens in een microcentrifuge bij 16.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Draai na centrifugering het supernatant, oftewel de nucleoplasmatische fractie, over in een buisje van 1,5 ml en bewaar dit bij 4 °C. Resuspendeer vervolgens de pellet in 1,5 ml digestiebuffer die is voorverwarmd tot 37 °C.

Incubeer de fractie vervolgens 10 minuten bij 37 °C. Voeg daarna 42 µL vijfmolaire natriumchloride toe om de uiteindelijke concentratie natriumchloride op 150 millimolair te brengen en incubeer dit 20 minuten op ijs. Centrifugeer 10 minuten bij 16.000 ×g in een microcentrifuge bij 4 °C.

Verwijder na het centrifugeren het supernatant en bewaar dit bij vier graden Celsius. Dit is de CH one 50 fractie. Resuspendeer het pellet in 1,5 milliliters koud high salt buffer en incubeer dit gedurende 20 minuten op ijs.

Centrifuge bij 16.000 ×g in een microcentrifuge bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en bewaar dit bij vier graden Celsius. Dit is de CH 500-fractie.

Haal de fracties die tijdens het fractioneringsprotocol zijn bewaard uit de vriezer en plaats ze op ijs. Voeg vervolgens 300 µL van vijf molair natriumchloride toe aan de cytoplasmatische fractie. Breng daarna per fractie 100 µL gepakte strep T in Sphero beads over naar een conische buis van 15 milliliter.

Voeg 10 volumes strep-wasbuffer toe aan de beads. Keer de buis om om te mengen en centrifugeer vijf minuten bij 1000 ×g in een tafelcentrifuge; verwijder de bovenzijde.

Herhaal de wasstap met de buffer twee keer en resuspendeer vervolgens de pellet in een gelijk volume strep-wasbuffer; voeg 200 µL gewassen strep-actine-kraal-slurry toe aan elke fractie. Roteer de buisjes gedurende één uur bij 4 °C. Centrifugeer de buisjes daarna gedurende één minuut bij 1000 ×g bij 4 °C en verwijder het supernatant.

Voeg vervolgens één milliliter wasbuffer toe aan de beads die zijn geïncubeerd met de cytoplasmatische fractie in een buis van 15 milliliter. Voeg de wasbuffer toe en breng de beads over naar een buis van 1,5 milliliter. Was de beads gedurende één minuut en centrifugeer de buizen vervolgens gedurende één minuut bij 1000 ×g bij vier °C.

Herhaal dit tweemaal na de laatste wasstap. Verwijder alle resten van de wasbuffer met een platte pipetpunt. Voeg vervolgens 100 µL elutiebuffer toe, meng voorzichtig en plaats de buisjes gedurende 15 minuten op ijs.

Meng de beads tijdens de incubatie af en toe door voorzichtig tegen de onderkant van de buisjes te tikken. Centrifugeer na 15 minuten gedurende één minuut bij 1000 ×g bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant dat de geëlueerde strep-tagged VRP's bevat.

Hier werden onze cellen gedurende negen uur geïnfecteerd met het influenzavirusstam WSN, en de gefractioneerde lysaten werden geanalyseerd via western blotting, zoals hier wordt getoond. Zachte nucleaire isolatie extraheert efficiënt cytoplasmatische eiwitten zoals tubuline, terwijl de vrijgave van overvloedige nucleaire eiwitten wordt vermeden. Let op dat de chromatinefractie die met een lage zoutconcentratie is geëxtraheerd, verrijkt is met eiwitten die belangrijk zijn voor transcriptie.

Terwijl de fractie met een hoog zoutgehalte voornamelijk nucleosomen bevat, werden om de eiwitsamenstelling van de geëlueerde cytoplasmatische fractie te bepalen vRNP's uit he R-cellen die negen uur waren geïnfecteerd met niet-getagd virus, RWSN of RWSN PB2-strep geanalyseerd via zilverkleuring, zoals getoond voor een cytoplasmatisch eluaat. Hier is een hoge ratio NP ten opzichte van PA, PB1, PB2, wat blijkt uit de prominente band boven 55 kilodalton vergeleken met de banden tussen 95 en 100 kilodalton; dit suggereert dat het meeste strep-PB2 wordt gezuiverd als onderdeel van een volledig gevormd vRNP, of met andere woorden, dat er weinig oplosbaar polymerase wordt opgevangen om relatieve opbrengsten te vergelijken. vRNP's gezuiverd na negen uur infectie met RWSN PB2-strep of RWSN zijn zilvergekleurd zoals getoond in deze zilverkleuringsgel; vRNP's kunnen uit alle vier de cellulaire fracties worden gezuiverd na negen uur infectie.

De hoogste concentratie v RMPs bevindt zich in het nucleaire plasma, hoewel er ook aanzienlijke hoeveelheden uit het cytoplasma en chromatine kunnen worden gezuiverd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u hoge opbrengsten van intacte ribonucleoproteïnecomplexen van het influenzavirus kunt zuiveren uit de kern van geïnfecteerde cellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om schone buffers te gebruiken en te voorkomen dat de monsters onnodig worden blootgesteld aan kamertemperatuur; op deze manier kunt u zowel RNA- als proteïnedegradatie voorkomen, alsofzoals het uiteenvallen van proteïnecomplexen.

En vergeet niet dat werken met een infectieus influenzavirus gevaarlijk kan zijn. Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een werkbank voor biosafety level 2 totdat NP 40 aan de lysaten is toegevoegd.