Collectie Protocol for Human Pancreas

Het algemene doel van deze procedure is om de menselijke pancreas te dissecteren op een manier die de anatomische oriëntatie behoudt. Dit wordt bereikt door het duodenum en de milt van de pancreas te verwijderen, waarna overtollig vet en vaten van de pancreas worden weggenomen. De tweede stap is om het anterieure oppervlak met blauwe inkt en het posterieure oppervlak met zwarte inkt te inkleuren.

Vervolgens wordt de pancreas in drie regio's verdeeld. Elke regio wordt daarna dwars in gelijkmatige plakken gesneden en geplaatst in paraffinecassettes, OCT-vormpjes, of verder fijngehakt en in vials geplaatst. Uiteindelijk worden monsters verzameld uit alle drie de regio's van de pancreas, waarbij de juiste anatomische oriëntatie wordt behouden voor toekomstige analyse.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het onderzoek naar diabetes type 1, zoals de mechanismen die ten grond liggen aan het verlies van bètacelmassa of -functie, en de aard van de aanval door immuuncellen. Een visuele demonstratie van de verwerkingsmethode van de pancreas is cruciaal, aangezien het behoud van de in vivo oriëntatie van de pancreas veel aandacht voor detail vereist. De procedure wordt gedemonstreerd door Linda Snyder, histotechnoloog, en Emily Montgomery, biologisch wetenschapper in mijn laboratorium.

Begin met het voorbereiden van alle materialen die nodig zijn voor de procedure. Label eerst de cassettes waarin de paraffineblokken worden geplaatst met een donoridentificatie, het monstertype, het aliquotnummer en eventuele aanvullende informatie. Label vervolgens de OCT-vormpjes op dezelfde wijze.

Knip voldoende stukken aluminiumfolie af om elk OCT-blok in te wikkelen en leg deze apart voor later gebruik. Bereid alle vials voor die nodig zijn om de verse en bevroren monsters te bewaren. Voeg RNA later en RPMI-medium toe waar适当.

Bereid vervolgens de werkgebieden voor door dissectieplanken, gesteriliseerde instrumenten en alle overige benodigdheden voor de procedure zowel in een biosafety-kast als op een aanrecht te plaatsen. Zorg dat alle cassettejes en OCT-vormpjes in de volgorde van gebruik klaarstaan. Maak een vriesbad door voldoende isopentaan toe te voegen om het droogijs op de bodem van een piepschuimdoos te bedekken.

Om met de dissectie te beginnen, verwijdert u het duodenum en de milt. Begin met het scheiden van het duodenum en de pancreas aan één uiteinde en ga door tot ze volledig zijn losgekoppeld. De milt is losbevestigd en is eenvoudig te verwijderen uit het vet en de pancreas.

Reinig vervolgens de pancreas door overtollig vet, bloedvaten en zenuwen te verwijderen met een combinatie van botte en scherpe dissectie. Bewaar het vet en de lymfeklieren apart voor verdere verwerking. Plaats de gereinigde pancreas vervolgens op een dissectieplank die is bedekt met papieren handdoeken.

Het behouden van de juiste oriëntatie van de pancreas is het moeilijkste aspect van deze procedure. Om succes te garanderen, worden de anterieure en posterieure oppervlakken ingekleurd met inkt van verschillende kleuren. Doop een wattenstaafje in blauwe inkt, verspreid de inkt over het anterieure oppervlak van de pancreas en dep het teveel weg.

Doop vervolgens een nieuwe applicator in zwarte inkt en verdeel deze over het posterieure oppervlak van de pancreas. Breng de pancreas terug naar de normale oriëntatie. Met het anterieure oppervlak naar boven is de pancreas nu klaar om in drie secties te worden gesneden.

Snijd eerst de verbinding tussen de kop en het lichaam door. Verdeel vervolgens het resterende deel in ongeveer gelijke porties om het lichaam en de staart te scheiden, en noteer het gewicht van elk deel van de pancreas. Begin met het kopgedeelte.

Verdeel elk gebied in secties van ongeveer 0,5 centimeter door dwars door te snijden, vergelijkbaar met het snijden van een brood. Zodra elk gebied van de pancreas is in plakken gesneden, verwijdert u de laatste sectie van het kopgebied, namelijk de sectie van de overgang tussen kop en lichaam, en plaatst u deze op een apart dissectiebord. Hak deze sectie in kleine stukjes en verdeel de stukjes gelijkmatig over gelabelde cryovials met en zonder RNA.

Vervolgens worden de vials ingevroren, volgens de standaardprocedures. Herhaal deze procedure voor het sectie van de overgang tussen het lichaam en de staart.

Zodra de fijngehakte monsters zijn verzameld, worden alle transversale doorsneden naar rechts gekanteld. Om en om worden doorsneden van elke regio verwijderd. Verwijder bij paraffine- en OCT-blokken de eerste doorsnede voor paraffineblokkering.

Als een sectie te groot is, snijd deze dan doormidden. Label de cassettes als A en B. Als het stuk nog steeds te groot is, snijd dan elke sectie loodrecht op de vorige snede en label de cassettes vervolgens van A tot D in de klokrichting. Zoals hier te zien is, plaatst u de cassette zodanig dat het label zich aan de linkerkant bevindt.

Plaats vervolgens het weefsel in de cassette en sluit het deksel. Breng de cassette over naar een container met neutraal gebufferde formaline. Nummer de blokken opeenvolgend binnen elke regio, beginnend met de meest mediale sectie voor OCT-blokken.

Giet een dunne laag OCT-medium in een vooraf gelabelde mal. Voordat het weefsel wordt geplaatst, wordt het weefsel bedekt met OCT-medium en wordt het monster snel ingevroren voor later gebruik, waarbij wordt teruggegrepen op het weefsel dat eerder opzij was gezet. Isoleer de pancreatische lymfeklieren door het vet en het bindweefsel rondom het kapsel van de klier weg te snijden. Plaats de klieren in een steriele schaal met DMEF en versnij grote klieren in stukjes van maximaal 0,5 centimeter.

Zodra de pancreatische lymfeklieren zijn geïsoleerd, wordt het weefsel verdeeld over de voorbereide vials en cassettes voor verdere verwerking. Na de lymfeklieren wordt de milt fijngehakt en op vergelijkbare wijze bewaard. Om het duodenum te verwerken, wordt een vochtig gaasje gebruikt om het slijm van het mucosa te vegen, waarna het mucosa wordt afgeknipt en in secties wordt gesneden.

Verdeel de mucosa-monsters zoals eerder beschreven. Met deze procedure worden representatieve monsters van elk gebied van de pancreas verzameld, zoals hier te zien is. De gewichten van de kop-, lichaam- en staartregio waren ongeveer gelijk.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe een menselijke pancreas verwerkt kan worden tot verschillende monstertypes, in het bijzonder het vermogen om de oriëntatie te behouden, alsmede hoe lymfeklieren uit het peripancreatische vet geïsoleerd kunnen worden.