Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Het algemene doel van deze procedure is om snel muis-intestinale dendritische cellen of dc's en macrofagen te isoleren voor fenotypische en functionele karakterisering. Dit wordt bereikt door eerst het darmweefsel te oogsten. De tweede stap is het dissocieren van het darmepitheel van de lamina propria.

Vervolgens wordt de lamina propria van de darm verteerd tijdens de laatste stappen van de procedure. De cellen van de lamina propria worden gekleurd met fluorescente, geconjugeerde antilichamen en geselecteerd op specifieke celpopulaties. Uiteindelijk kunnen darm-DC- en macrofaagpopulaties nauwkeuriger worden gekarakteriseerd en gezuiverd voor functionele studies om de cytokin productie, antigeenpresentatie en de regulatie van immuuncellen te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de snelheid van de weefseldigestie een optimale expressie van celoppervlakantigenen, celviabiliteit en of cellulaire integriteit waarborgt. Nadat de muis is geëuthanaseerd en de dood is bevestigd via de teenknijpreflex, wordt 70%ethanol op de buik en thorax van het dier gespoten. Gebruik vervolgens een schaar om een kleine horizontale incisie in het midden van de buik te maken en pel de huid terug om het peritoneum bloot te leggen.

Open het peritoneum met een schaar nadat u heeft doorgeknipt bij de pylorus om de maag van de bovenste dunne darm te scheiden, en gebruik een pincet om het mesenterium weg te scheiden. Knip opnieuw bij de ileocecale klep om de gehele dunne darm van de dikke darm te bevrijden. Ga verder met het losscheuren van het mesenterium van de dikke darm en maak een incisie bij de anale opening.

Gebruik een schaar om de dikke darm in de lengte open te knippen en gebruik C-M-F-P-B-S op kamertemperatuur om de fecale inhoud en het slijm uit het lumen van de darm te spoelen. Gebruik vervolgens de schaar en een pincet om de Peyerse plaques macroscopisch te dissekeren langs het anti-mesenteriële oppervlak van de dunne darm, en knip de dunne darm in de lengte open.

Maak vervolgens het lumen van de dunne darm vrij van fecale inhoud en slijm met meer C-M-F-P-B-S op kamertemperatuur. Snijd de dunne en dikke darmen apart in stukken van ongeveer 1,5 centimeter en plaats de stukken in individuele conische buizen van 50 milliliter die 30 milliliter pre-war C-M-F-H-B-S-S met FBS en twee millimolar EDTA bevatten. Plaats elke conische buis van 50 milliliter horizontaal in een orbitale schudmachine en schud de buizen 20 minuten lang bij 250 RPM op 37 graden Celsius.

Plaats vervolgens een enkele zeef van gaasdraad over een afvalemmer. Giet de inhoud van elke kegelvormige buis van 50 milliliter door het gaas om de stukjes darm te herstellen en plaats deze vervolgens in nieuwe individuele kegelvormige buizen van 50 milliliter die 30 milliliter bevatten van voorverwarmde C-M-F-H-B-S-S met FBS en twee millimolar EDTA. Plaats de buizen tot slot nog 20 minuten terug in de orbital shaker.

Giet na de tweede ronde van schudden de inhoud van elke buis door de zeef. Dep opnieuw het overtollige medium weg met een papieren handdoek en breng de stukjes darm vervolgens over naar een klein plastic weegbakje. Het meest kritische aspect van deze techniek is de weefseldigestie; om succes te garanderen moeten alle verschillende parameters, zoals de duur van de digestie, de eigenschappen van de collagenase, de integriteit van het weefsel en de grootte van het te digereren weefsel (door het snel met een schaar te versnijden), in overweging worden genomen.

Hak de darmstukken fijn en voeg de fijngehakte darm vervolgens toe aan een conische buis van 50 millimeter die 20 milliliters collagenase-oplossing bevat. Plaats de conische buis horizontaal in de orbitale schudmachine en verteer de darmstukken gedurende 10 tot 20 minuten bij 200 RPM en 37 graden Celsius. Vortex de buis nu kort om volledige dissociatie van elk overgebleven darmweefsel te waarborgen en filtreer vervolgens de cel suspensie door een celzeef van 100 micron direct in een conische buis van 50 milliliter.

Vul tenslotte de conische buis aan met C-M-F-H-B-S-S met FBS en centrifugeer de celoplossing twee keer gedurende vijf minuten bij 425 ×g bij vier graden Celsius. Giet vervolgens het supernatant af en resuspendeer de celpellet in ijskoud C-M-F-H-B-S-S met FBS en plaats de monsters op ijs. Daarna volgt het kleuren van de cellen voor de gewenste oppervlakte-eiwitten.

Begin met het maken van een dotplot waarbij de cellen die positief zijn voor de kleuring voor dode cellen worden uitgesloten, zoals hier gedemonstreerd. Sluit vervolgens dublet-events uit, zoals hier en hier getoond. Gebruik nu de forward en side scatter kanalen om de cellen van belang te selecteren, waarbij u er zeker van bent dat debris wordt uitgesloten.

Maak vervolgens een andere dotplot waarbij selectie wordt gemaakt op de CD 45-positieve en IAB-positieve antigeenpresenterende cellen in een aparte dotplot. Creëer regio's om specifieke DC- en macrofaagsubsets te onderscheiden. De hier getoonde R1-regio bevat de CD 11 C-positieve en CD 11 B-zwakke/negatieve cellen.

Regio R twee bakent de cellen af die een vergelijkbaar niveau van oppervlakte-expressie voor CD 11 C hebben als de cellen in regio R één, maar die ook CD 11 B tot expressie brengen. De regio's R drie duiden de cellen aan die CD 11 B positief en CD 11 C zwak negatief zijn. Deze drie regio's kunnen verder worden geanalyseerd op F four 80 en CD 1 0 3 expressie om respectievelijk macrofaag- en DC-populaties te differentiëren. Zoals te zien is in deze dotplot, zullen de CD 11 C positieve CD 11 B zwak negatieve cellen in regio R één hoge niveaus van alpha ein CD 1 0 3 en lage niveaus van F four 80 tot expressie brengen.

Deze dot plot laat zien dat CD 11 B positieve CD 11 C positieve cellen in de R2-regio zullen bestaan uit zowel DC's als macrofagen, op basis van hun dichotomische expressie van CD 1 0 3 en F four 80. Ten slotte, op basis van hun F four 80 positieve en CD 1 0 3 negatieve fenotypische profiel R3, zullen gegate CD 11 B positieve CD 11 C del negatieve cellen bestaan uit macrofagen. De relatie tussen de duur van de weefseldigestie, de totale celopbrengst en de expressie van CD 11 B en CD 11 C wordt geïllustreerd in de volgende zes figuren. Intestinaal weefsel dat gedurende drie minuten wordt gedigesteerd, levert een laag totaal aantal cellen op, resulterend in weinig beschikbare DC's en macrofagen voor karakterisering. Weefseldigestie gedurende 11 minuten produceert een robuuste opbrengst aan levende cellen, wat resulteert in populaties van DC's en macrofagen die hoge niveaus van CD 11 B en CD 11 C tot expressie brengen en fenotypisch onderscheidbaar zijn.

Daarentegen resulteert een digestie van 50 minuten in een vergelijkbare celopbrengst als bij de geoptimaliseerde digestie. Echter wordt de afbakening van verschillende celpopulaties met behulp van CD 11 B en CD 11 C moeilijker, aangezien de expressie van CD 11 C afneemt en het aantal dode cellen toeneemt.

Door de parameters voor de digestie van darmweefsel te optimaliseren, kan snel een robuuste celopbrengst worden behaald. Hierdoor kan de snelle isolatie van muizen-intestinale dc's en macrofagen nuttig zijn voor het evalueren van de functionele eigenschappen van immuuncellen met intacte oppervlakteantigenen.