Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie

Het algemene doel van de volgende procedure is het meten van de kinetiek en progressie van de celcyclus. Eerst worden cellen via een pulse-chase experiment gelabeld met romo, deoxyuridine of BrdU, dat in de plaats van thymidine in het DNA van de cel wordt ingebouwd. De cellen worden vervolgens immunogekleurd met antilichamen tegen BrdU en direct na het kleuren geanalyseerd met flowcytometrie.

Alleen cellen in de S-fase worden gelabeld terwijl de gelabelde cellen door de celcyclus naar G2 voortschrijden. Na mitose worden zij gedetecteerd als cellen met een 4N DNA-gehalte. Het DNA-gehalte wordt vervolgens gereduceerd tot 2N. Daarom kan analyse van de fluorescentieprofielen die met flowcytometrie zijn gegenereerd, worden gebruikt om de kinetiek van de celcyclusprogressie te bepalen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere protocollen die chemicaliën gebruiken voor celsynchronisatie, is dat er geen fysiologische verstoringen optreden die onbedoeld het celdelingsmechanisme kunnen beïnvloeden. We hebben deze methode voor het eerst toegepast toen onze pogingen om de snelheid van de celcyclusprogressie te bestuderen via chemische synchronisatie onverwachte resultaten gaven die onze analyse beïnvloedden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de celbiologie.

Wat is bijvoorbeeld de basis voor de differentiële groeisnelheden tussen verschillende celtypen? Begin dit protocol met een pulse-chase labeling van de cellen met BRDU om dit te onderzoeken. Begin met het labelen van één 10 centimeter plaat voor elk tijdstip, plus één voor elk van de volgende controles.

Alleen BRDU, alleen PI, BRDU-negatief, PI-negatief. Zaai elke plaat met five times 10 to the fifth MCF seven cellen in aangevuld DMEM. Incubeer de platen gedurende 24 tot 48 uur om de cellen de tijd te geven zich te herstellen en te hechten. Zodra de cellen een confluentie van 60% bereiken, wordt het medium vervangen door vers DMEM dat 10 micromolar bevat.

BrdU: incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C en 5% CO2 om de BrdU-incorporatie in het DNA mogelijk te maken. Zorg ervoor dat één plaat onbehandeld blijft om als negatieve controle of nultijdstip na één uur te dienen. Verwijder het medium voor pulslabeling en spoel de cellen kort af met PBS voor de tijdstippen van twee tot acht uur.

Voeg vers groeimedium toe en plaats ze terug in de incubator. Oogst vervolgens onmiddellijk de platen van het nulpunt en het tijdstip van één uur, zoals beschreven in de volgende sectie. Om de cellen te oogsten, wordt het medium afgezogen en de plaat gespoeld.

Spoel de cellen eerst met PBS en gebruik vervolgens trypsine om de cellen los te maken van de plaat. Verzamel de cellen in DMEM en centrifugeer deze bij 390 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant. Spoel de cellen vervolgens met 1 tot 5 mL ijskoud PBS en centrifugeer bij 390 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL ijs.

Koude PBS bevattend 1% FBS. Het FBS helpt celklontering te voorkomen. Een van de belangrijkste aspecten van deze procedure is om ervoor te zorgen dat u een suspensie van enkelvoudige cellen verkrijgt uit de geoogste cellen.

Voor feiten. Om dit te bereiken, kunt u uw cellen druppel voor druppel direct aan de ethanol toevoegen. Dit is cruciaal. Gebruik vervolgens de pipet om de cellen druppelsgewijs toe te voegen aan vijf milliliter ijskoud medium om de cellen te fixeren.

70% ethanol in een conische buis van 15 milliliter. Incubeer de cellen 30 minuten op ijs of bewaar ze gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Dit is een ideaal moment om de monstername van de verschillende tijdspunten te onderbreken; de monsters kunnen enkele dagen in ethanol blijven staan, waardoor ze gelijktijdig verder verwerkt kunnen worden volgens de rest van het protocol voor de BRDU- en propidiumjodidekleuring.

Haal de cellen uit de koeling bij 4 °C en centrifugeer ze 3 keer bij 90 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer na het centrifugeren het grootste deel van het fixeer middel, waarbij ongeveer 50 µL overblijft. Vortex vervolgens.

Om het pellet los te maken voor de denaturatie van het DNA tijdens het vortexen. Voeg langzaam druppelsgewijs 1 mL 2N HCl Triton X 100 toe en incubeer de monsters vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur. Pelleteer de cellen door de monsters vijf minuten te centrifugeren bij 390 ×g; aspireer daarna het supernatant en gooi dit weg.

Resuspendeer vervolgens de celpellet in één milliliter 0,1 molair natriumtetraboraat. Aspireer na het centrifugeren de cellen opnieuw en gooi het supernatant weg. Resuspendeer vervolgens de celpellet in 75 µL BrdU-kleuring.

Meng en incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht na de incubatie. Pelletiseer de cellen door centrifugatie zoals voorheen en resuspendeer de celpellet in één milliliter PBS met vijf microgram per milliliter propidiumjodide. Maak bij het analyseren van het PI-positieve monster via de flowcytometer een forward scatter versus side scatter plot om de juiste grootteverdeling van de cellen te controleren.

Beide parameters moeten op een lineaire schaal worden uitgezet. Bekijk gelijktijdig een plot van FL drie H versus FL twee W om de PI-kleuring ten opzichte van de fluorescentie-pulsbreedte te bekijken. Deze plot wordt gebruikt om een gate te creëren om de fractie cellen te isoleren die naar verwachting binnen het normale distributiepatroon van de celcyclus vallen.

Over het algemeen wordt dit distributiepatroon gekenmerkt door twee clusters cellen met respectievelijk twee N en vier N DNA-gehalte bij PI-kleuring, die de G1- en G2-fasen van de celcyclus vertegenwoordigen. Een reeks cellen tussen deze twee clusters is representatief voor de lopende DNA-replicatie die plaatsvindt in de S-fase van de celcyclus. Maak een plot waarin de gegatede cellen worden weergegeven met FL1 H of FITC op een logaritmische schaal op de Y-as en PI op een lineaire schaal op de X-as.

Deze plot zal worden gebruikt om de overige parameters in te stellen met behulp van de verschillende controles, alsovols om data te verzamelen. Plaats voor de analyse de monster met alleen PI-kleuring in de laadpoort van de flowcytometer en stel de gain zo in dat G1 op ongeveer 200 op de x-as komt te liggen. Dit is gemakkelijker te visualiseren in een histogramplot van de PI-kleuring.

Plaats vervolgens de monster met alleen BRDU in de laadpoort en start de run. Pas de gain aan zodat de twee celpopulaties, BRDU-positief en BRDU-negatief, op de plot verschijnen. Idealiter zijn de BRDU-negatieve cellen gepositioneerd op of net onder 10¹.

De laatste controle is het BrDU/PI-negatieve monster. Voer deze negatieve controle uit om er zeker van te zijn dat de cellen niet verschijnen in een van de bovenste of rechterkwadranten. Zodra de parameters van de verschillende plots zijn ingesteld, is de flowcytometer gekalibreerd en klaar voor de verwerking van BrDU- en PI-gekleurde cellen. Verzamel gegevens van minimaal 10.000 PI-gegate cellen per monster.

Maak vervolgens met software zoals FlowJo of fax diva een plot van FITC tegenover PI, waarbij de cellen uit de PI versus FL twee W-plot worden gegated als PI-positief, om de cyclerende populatie te onderscheiden. Genereer daarna een tweede gate om de BRDU-positieve populatie te isoleren.

Om vervolgens het verloop van de celcyclusprogressie te volgen, wordt het aantal BrdU-positieve cellen met G1- of G2-inhoud uitgezet als functie van de tijd om de kinetiek van de celcyclusprogressie tussen twee colorectale cellijnen, HT 29 en LS 180, te vergelijken. Cellen werden elk uur gedurende acht uur verzameld na het verwijderen van de BrdU-puls.

Bij het vergelijken van de kinetiek van de twee profielen is de verschijning van een G1-piek duidelijk zichtbaar op t gelijk aan vier uur na BRDU in de LS 180-cellen, vergeleken met het overeenkomstige tijdstip voor de HT 29-cellijn, waarbij deze piek ontbreekt. Dit wijst op een versnelde progressie van de celcyclus door de G2-fase van de celcyclus. In de colorectale cellijn LS 180 om een cyclusprofiel van de borstkankercellijn te genereren.

MC zeven cellen werden elk uur gedurende acht uur verzameld, na verwijdering van de BRDU-puls. De immuungelabelde cellen en cellen met DNA-tegenkleuring werden vervolgens gesorteerd op basis van hun fluorescentiesignalen.

Zoals hier te zien is, doorliepen CF seven-cellen hun cyclus met een aanzienlijk lagere snelheid dan beide geteste colorectale cellijnen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe metabolische labeling van DNA in combinatie met oogsten op specifieke tijdstippen u in staat stelt om de celcycluskinetiek te volgen.