Computed Tomography-begeleide tijd-domein Diffuus fluorescentie tomografie in kleine dieren voor het lokaliseren van Cancer Biomarkers

Het algemene doel van het volgende experiment is het produceren van fluorescentiebeelden van de expressie van de epidermale groeifactorreceptor in een orthotoop glioommuismodel. Dit wordt bereikt door de linker hersenhemisfeer van een A IIC-muis te inoculeren met menselijke U2 51-glioomcellen die groen fluorescent eiwit tot expressie brengen. Nadat de tumor twee weken is gegroeid, wordt de muis geïnjecteerd met een cocktail van twee fluorescente tracers.

De muis wordt vervolgens gefotografeerd met een röntgensysteem voor kleine dieren om anatomische gegevens te verzamelen die nodig zijn voor een nauwkeurige beeldreconstructie. Deze gegevens worden gebruikt om de bron- en detectielocaties van het optische tomografiesysteem anatomisch te positioneren, en er wordt aangepaste software gebruikt om de fluorescentiegegevens te verzamelen en het uiteindelijke beeld te construeren. Uiteindelijk kan deze methode, door gebruik te maken van zowel fluorescentie- als röntgenbeeldvorming, een beeld van een tumor construeren op basis van de overexpressie van epidermal growth factor, waarvan de nauwkeurigheid vergeleken kan worden met contrastversterkte magnetic resonance imaging.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fluorescentietomografie voor kleine dieren op basis van charge-coupled devices, is dat detectie via single photon counting met fotomultiplicatorbuizen een veel hogere gevoeligheid en een groter dynamisch bereik voor lichtdetectie biedt. Deze methode kan uiteindelijk worden gebruikt om het succes van moleculaire therapieën te monitoren en te beoordelen door de expressie van hun doelwitten te meten. Hoewel subcutane tumoren gemakkelijk kunnen worden afgebeeld met niet-tomografische methoden via oppervlakte-imaging, is dit systeem ontworpen om door weefsel tot enkele centimeters dik te beelden, waardoor het bijzonder geschikt is voor het in beeld brengen van de afgifte en lekkage van contrastmiddelen in hersentumoren.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de expressie van kankerbiomarkers, kan zij ook worden toegepast op andere ziektestudies, zoals infecties, obesitas of verouderingsgerelateerde aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de diffuse aard van lichtvoortplanting in biologisch weefsel en de complexiteit van het gebruik van röntgentomografie voor de reconstructie van diffuus licht. Een visuele demonstratie van deze methode is daarom essentieel.

Aangezien de stappen voor gegevensverzameling en beeldreconstructie moeilijk te leren kunnen zijn, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de gegevens die uit het fluorescentiesysteem worden verzameld, goed zijn gekalibreerd. Het softwarepakket near fast is ontworpen om optische gegevens in te lezen en röntgentomografiebeelden te gebruiken voor het maken van een eindige-elementennet, dat dient als ruimtelijk sjabloon voor de fluorescentiereconstructie. Begin met het plaatsen van een geanestheseerde athymische naakte muis op een steriel chirurgisch laken en bevestig de diepte van de anesthesie voordat u verdergaat met het reinigen en desinfecteren van de huid boven het incisiegebied.

Breng met Betadine een steriel chirurgisch afdekdoek aan over de incisieplaats. Maak met een scalpel een kleine incisie net links van de middellijn en 0,5 centimeters posterior ten opzichte van de intraoculaire lijn. Reinig het oppervlak van de schedel door al het bindweefsel te verwijderen zodat de referentiepunten kunnen worden geïdentificeerd. Zodra de schedel is blootgelegd, gebruik een hogesnelheidsboor met een steriele boor van één millimeter om een gat te maken dat twee millimeters links van de centrale lijn en twee millimeters achter de bgma ligt.

Vul een Hamilton Micros-spuit met een stompneidige naald van 27 gauge met de te implanteren cellen. Plaats de muis vervolgens in een stereotaxisch frame. Bevestig daarna een diep chirurgisch en anesthetisch vlak met een knijptest in de teen en plaats het chirurgische afdekdoek terug op het dier.

Bevestig vervolgens de gevulde spuit aan het stereotaxische frame. Positioneer de spuit boven het gat in de schedel en breng de naaldpunt drie millimeter onder het schedeloppervlak in. Trek de naald vervolgens één millimeter terug om een pocket te creëren.

De volgende stap is om de cellen gedurende een periode van vijf minuten langzaam in de linker hersenhelft te injecteren. Zodra de injectie is voltooid, wordt de naald teruggetrokken en het gat gedesinfecteerd met Betadine. Om te voorkomen dat cellen buiten de injectieplaats groeien, wordt de muis uit het stereotactische frame gehaald en het openliggende gat opgevuld met voorverwarmde botwas.

Sluit tot slot de incisieplaats met steriele nylon hechtdraad 5-0. Plaats de muis terug in een verwarmde kooi en houd deze in de gaten tot het herstel is voltooid; injecteer de muis na het herstel IP met 130 µL buprenorfine (0,1 mg/kg) en laat de tumor 14 dagen groeien voorafgaand aan de beeldvorming. Start op de dag van de beeldvorming van de muis het systeem op, zodat de lasers en lichtdetectoren ongeveer 20 minuten kunnen opwarmen.

Om drift en systeemgevoeligheid te voorkomen, plaatst u een lineaire diffuser van 100 graden bij vier graden precies in het midden van het imaging gantry om de excitatielasers met gelijke intensiteit over de detectiekanalen van het systeem te verspreiden. Pas de hoek van de diffuser handmatig aan om de hoeveelheid signaal die door alle vijf de lichtopvangkanaal wordt gedetecteerd te maximaliseren. Plaats vervolgens de optische dichtheid.

Twee neutrale dichtheidsfilters voor alle fotomultiplicatierbuizen voor fluorescentiedetectie, genaamd PMT's, en optische dichtheid. Eén neutraal dichtheidsfilter voor alle transmissiedetectie. De PMT's verzamelen 100 temporele pulsspreidingsfuncties of T psfs van de laser, elk met een integratietijd van één seconde voor elke laser opeenvolgend; normaliseer elke TPSF met de laserreferentie, corrigeer voor temporele drift in de laserreferentie en bereken het gemiddelde over alle iteraties voor elke detector en elke laser afzonderlijk.

Deze gemiddelde TPS-waarden zijn de detectorspecifieke instrumentresponsfuncties die worden gebruikt bij de optische beeldreconstructie 12 uur vóór de beeldgevingsprocedure. Injecteer de testmuis met een cocktail van fluorescente tracers. De nauwkeurige kalibratie van het fluorescentie-tomografiesysteem en het beperken van de beweging van het dier zijn de meest uitdagende aspecten van deze procedure.

De beeldreconstructie is zo slecht gesteld dat zelfs geringe fouten bij de gegevensverzameling kunnen leiden tot aanzienlijke fouten in het gereconstrueerde beeld. Om te waarborgen dat er nauwkeurige gegevens worden verzameld, immobiliseren we de muis zo goed mogelijk en herhalen we de kalibratie vóór en na het scannen om de kans op een nauwkeurige kalibratie te vergroten. Wanneer u klaar bent, plaatst u het geanestheseerde dier op de glasvezelsteunen van de beeldvormingstafel.

Nadat de kop voor continue gasanesthesie in de neuskegel is geplaatst, worden de tanden op de bijtstrip gefixeerd en wordt het dier vastgetaped. De muis moet ongeveer in het midden van het imaging-gantry worden geplaatst. Deze positionering kan worden begeleid door de excitatielaser 180 graden rond de muis te draaien, zodat wordt gewaarborgd dat het brandpunt van de laser vanuit alle hoeken een punt ongeveer in het midden van de muis belicht.

Zodra deze correct zijn gepositioneerd, worden het beeldplatform en de muis zorgvuldig overgebracht naar de micro-CT-scanner om anatomische informatie te verzamelen met een isotrope resolutie van 93 micrometers voor de gehele kop van de muis. Visualiseer de CT-beeldstack en selecteer de coupes die met het fluorescentietomografiesysteem moeten worden afgebeeld. Breng het beeldplatform en de muis vervolgens zorgvuldig terug naar het fluorescentietomografiesysteem.

Kies het aantal bronposities voor elke beeldgevingsslice, de integratietijd voor elke TPSF-meting, het aantal iteraties per bronpositie, en de positie en het aantal gewenste beeldgevingsslices uit de eerder gemaakte CT-beeldstack. Plaats vervolgens filters voor de fluorescentiedetectie-PMT's om al het excitatielicht te blokkeren en neutraaldichtheidsfilters voor de transmissiedetectie-PMT's. Om verzadiging van deze detectoren te voorkomen, start u de software voor gegevensverwerving om fluorescentie- en transmissie-t psf's te verzamelen bij elke gedefinieerde bron-detectorpositie bij beide excitatiegolflengten.

Monitor en registreer voor elke verzamelde set T psfs de laserintensiteit met een referentie-PMT-kanaal. Bepaal het buitenoppervlak van de muis en de locatie van de imagingbed. Ondersteun de staven op basis van de CT-beelden en maak maskers die de grenzen van de muis en de imagingstaf beslaan.

Gebruik apart het muizenmasker om met de software Near Fast een eindige-elementennet (finite element mesh) van het dier te genereren. Lokaliseer de posities van de bronnen en detectoren van het fluorescentie-tomografiesysteem op het oppervlak van het net op basis van de ruimtelijke registratiecoördinaten van de micro-CT en fluorescentie. Verwijder optische datapunten die behoren tot bron- of detectorposities die interfereren met de locatie van de beeldvormingstafel.

Ondersteuningsstaven normaliseren de gegevens die bij elke bron-detectorkoppeling zijn verzameld aan de hand van de laserreferentie, corrigeren voor temporele drift in de laserreferentie en corrigeren voor filtergevoeligheden, die door experimentele tests bij aankoop zijn bepaald. Bereken de Born-ratio van de gegevens voor elke bron-detectorkoppeling en vermenigvuldig deze met een forward model-simulatie van de transmissie, gebaseerd op het finite-element-mesh van het dier voor uniforme optische eigenschappen. Dit wordt gedaan om fouten te verminderen die verband houden met de koppeling van de bron of detector aan het weefsel, om de gegevens te kalibreren aan het model en om gegevens aan te passen voor andere aspecten van discrepanties tussen de modelgegevens; stel vervolgens een datavector samen bestaande uit het geschaalde verschil van de Born-ratio-gegevens die bij beide golflengten zijn verzameld.

De schaalfactor wordt gekozen om het EGFR-bindingscontrast te maximaliseren; vervolgens wordt tijd domein beeldreconstructie uitgevoerd met de gekalibreerde differentiegegevens, waarbij de TPSF voor elk detectiekanaal als input dient, om fluorescentiekaarten te maken van de waargenomen contrastversterkte doelgerichte tracer. Hier is een voorbeeld van een fluorescentiereconstructie geprojecteerd op een gecoregistreerd CT-anatomisch beeld van een muis met een U2 51 orthotope glioomtumor. Het zwaartepunt van het glioom, bepaald door de fluorescentiereconstructie, bevond zich binnen één millimeter van het zwaartepunt van de tumor, bepaald door contrastversterkte magnetische resonantiebeeldvorming.

De software voor gegevensacquisitie is speciaal voor dit apparaat ontwikkeld, maar de meeste technieken voor beeldbewerking kunnen worden uitgevoerd met de near fasts-software die beschikbaar is op nearfasts.org. Bij het uitvoeren van deze procedure is het daarom belangrijk om ervoor te zorgen dat zowel het systeem als de gegevens nauwkeurig zijn gekalibreerd vóór de beeldreconstructie. Deze kalibratie vereist dat er rekening wordt gehouden met de gevoeligheids- en tijdsverschillen tussen de detectoren na de beeldreconstructie van een biomarker-gerichte tracer.

Vergelijkbare beeldvorming van een niet-getargete tracer biedt een methode om te corrigeren voor niet-receptor-gemedieerde opname. Hierdoor kan, na de ontwikkeling ervan, zowel de hoeveelheid tracerbinding als de in vivo receptordichtheid worden gekwantificeerd. Deze techniek inspireerde andere onderzoekers om röntgenbeeldvorming-gestuurde fluorescentietomografiesystemen te ontwerpen en maakte de weg vrij voor whole-body imaging van grotere dieren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een experiment voor diffuse fluorescentietomografie uitvoert, waarbij röntgen anatomische beeldvorming en optische beeldvormingssystemen worden gecombineerd voor de beeldvorming van cancerbiomarkers.