Inzicht in Cerebellaire patroonvorming

Ik ben Kathy Millan. Ik ben universitair hoofddocent aan de University of Chicago bij de afdeling Humane Genetica en tevens bij de afdeling Neurologie. Ik doe onderzoek naar de ontwikkeling van de hersenen, en specifiek naar de ontwikkeling van de Cere Butler, het cerebellum, het deel van de hersenen hier achteraan, aan de achterzijde van de schedel.

Het staat het meest bekend om zijn rol bij de motorische ontwikkeling, maar het blijkt betrokken te zijn bij veel zaken. En het is een zeer interessant deel van de hersenen. Patroonvorming is de ontwikkeling van een patroon in een biologisch systeem. En het is een van die termen die ontwikkelingsbiologen op een vrij breed scala aan manieren gebruiken om bijna alles aan te duiden.

En het is niet echt duidelijk wat het betekent. Ik denk dat elke ontwikkelingsbioloog een andere versie zou geven van wat het voor mij betekent. Wat het betekent is: hoe weet de hersenen, of in het bijzonder het cerebellum, wat boven en onder is, en hoe definieer je links en rechts?

Hoe wordt bepaald welk deel van de structuur welk specifiek onderdeel wordt? En zodra die kritieke, fundamentele vroege embryonale beslissingen zijn genomen, hoe breng je al die cellulaire structuren samen om het uiterst nauwkeurig gepatteerde deel van de hersenen te vormen dat we het cerebellum noemen? We zijn dus echt geïnteresseerd in de ontwikkeling van het cerebellum en de patrooninformatie in het ontwikkelende cerebellum.

Omdat het cerebellum een uiterst fijnmazig gepatrooneerd weefsel is. Het bevat niet zo veel cellagen en niet zo veel celtypen. In vergelijking met andere delen van de hersenen is het dus een relatief eenvoudige structuur.

Daarnaast heeft het cerebellum een zeer specifieke functie, of is één van de vele functies de motorische coördinatie. Wanneer muizen of mensen cerebellaire afwijkingen hebben, is een van de resulterende fenotypen motorische incoördinatie. Gedurende de afgelopen honderd jaar van de muisgenetica zijn er daarom meerdere spontane muismutanten ontdekt en in zekere mate gekarakteriseerd, maar er zijn er ook simpelweg geïsoleerd en bewaard bij Jackson Labs, waarbij het gaat om muizen met motorische afwijkingen.

En een groot aantal van die muizen, ik geloof dat het er meer dan 60 spontane stammen zijn, vertonen afwijkingen in de ontwikkeling van het cerebellum. Die bron is een zeer waardevolle en rijke bron om te onderzoeken welke ontwikkelingsmechanismen de patroonvorming van het cerebellum aansturen. Eén ding waar mijn lab zich op richt, is om alle instrumenten die we hebben gekregen van het Human Genome Project en het Mouse Genome Project te gebruiken, en deze moleculaire reagentia in te zetten om de genen te vinden die gemuteerd zijn in al die spontane mutanten.

Door deze mutanten op te sporen, hanteren we een fenotype-centrische benadering om genen te vinden. We selecteren dus niet willekeurig genen om deze uit te schakelen. We identificeren eerst fenotypes en zoeken vervolgens de genen, omdat we met deze aanpak specifiek genen vinden die bijzonder relevant zijn voor het betreffende systeem.

Ons laboratorium en veel andere laboratoria hebben een aantal van deze spontane muismutanten gekloond. Deze spontane muismutanten hebben geleid tot zeer interessante nieuwe biologische inzichten, omdat we een fenotype-gestuurde benadering hanteren.

We hebben geen vooroordelen over welk soort genen we zullen vinden. We zoeken niet specifiek naar dal ho-analogen of kanaalmutaties. We komen bij de genen die door de fenotypen worden bepaald.

En daarom leren we veel nieuwe biologie. Zo heeft mijn laboratorium, samen met een andere collega, Jim Linig, toen ik postdoc was, gewerkt aan een van de genen of fenotypen van een muismutant genaamd dre, wat Duits is voor spinner of tollen als een tol. Deze muismutanten ontstonden voor het eerst in 1929 in Duitsland en zijn verzameld bij Jackson Labs.

Er zijn meerdere allelen van deze specifieke locus, en het was bekend dat het cerebellum incorrect was gevormd. Alle typen cerebellaire cellen waren wel aanwezig, maar het patroon van het cerebellum was abnormaal. Het middelste gedeelte ontbrak; dit middelste gedeelte wordt het vermis genoemd.

En we ontdekten dat er bij deze muizen een vroeg embryonaal fenotype was dat leidde tot dat fenotype bij volwassenen. Het fenotype was het resultaat van een mutatie in een gen genaamd LMX1A, wat staat voor limb homeodomain containing box 1. Het LMX1A-gen is in feite een zeer interessant en belangrijk gen in de ontwikkelingsbiologie, omdat het een van de meest kritische genen is bij het bepalen van wat 'boven' is in het centrale zenuwstelsel, of wat dorsaal is.

Zonder deze zeldzame mutatie wist niemand eigenlijk wat dit gen deed. Sterker nog, het was om andere redenen ontdekt in insulineproducerende cellen in de pancreas. Andere onderzoekers hadden het bestudeerd vanwege een mogelijke rol bij diabetes.

Maar in werkelijkheid blijkt dat LMX1A op zichzelf geen rol speelt bij de ontwikkeling van de pancreas of de ontwikkeling van eilandjes van Langerhans. De belangrijkste rol tijdens de ontwikkeling is in feite het aansturen van de dorsale patroonvorming in het centrale zenuwstelsel. Toen we het DR-gen, het LMX1A-gen, voor het eerst kloneerden, realiseerden we ons dat het alleen tot expressie komt in het dorsale deel van het centrale zenuwstelsel.

En in feite wordt het niet alleen tot expressie gebracht in het dorsale deel van het centrale zenuwstelsel of de dakplaat die zich rond het cerebellum bevindt. Het wordt eigenlijk tot expressie gebracht in het dorsale deel van het centrale zenuwstelsel langs de gehele axiale lengte van het muizenembryo. En in feite wordt het langs de gehele axiale lengte van elk gewerveld dier tot expressie gebracht dat we tot nu toe hebben onderzocht.

En omdat het overal dorsaal tot expressie komt, redeneerden we dat het ook een dorsale rol moet hebben in andere delen van het centrale zenuwstelsel. Daarom hebben we veel tijd besteed aan het karakteriseren van het fenotype van de DR-muizen in het ruggenmerg, omdat het ruggenmerg een veel beter modelsysteem is voor het begrijpen van de ontwikkeling van het CZS dan het cerebellum, aangezien het driedimensionaal veel minder complex is. Het heeft veel minder driedimensionale structuur.

Toen we overschakelden naar het kuiken, konden we gebruikmaken van een groot aantal reagentia om uit te zoeken wat de rol van LMX1A in het ruggenmerg was. Vanuit het ruggenmerg keerden we terug naar het cerebellum. Om eerlijk te zijn denk ik dat we zonder de technologie van chick ation geen goed begrip zouden hebben gehad van wat het LMX1A-gen doet; een postdoc in mijn laboratorium, Victor Chiko, was de persoon die deze experimenten echt heeft opgepakt en verder heeft uitgewerkt.

Hij was de persoon die daadwerkelijk heeft ontdekt wat het LMX1a-gen doet en wat de primaire rol ervan is in het centrale zenuwstelsel door gebruik te maken van het electroporatiesysteem bij kippen. En eerlijk gezegd denk ik niet dat we zoveel vooruitgang hadden kunnen boeken zonder electroporatie bij kippen. Electroporatie bij kippen is dus een zeer waardevolle technologie, omdat je genen snel kunt overexpresseren in het ontwikkelende zenuwstelsel van de kip, na twee of drie dagen incubatie resultaat kunt verkrijgen en analyseerbare fenotypes kunt waarnemen.

Als u daadwerkelijk genmanipulaties in muizen zou proberen voor transgene dieren, dan zou dat enkele maanden duren en voor knock-outs, enzovoort, zou dat ten minste anderhalf jaar duren. Daarom is het kiessysteem een zeer waardevol systeem, omdat u de genexpressie kunt manipuleren en fenotypes snel kunt vaststellen. Wanneer LMX1A overgeëxprimeerd wordt in het ontwikkelende zenuwstelsel van de kuiken, in het bijzonder het ontwikkelende ruggenmerg, zorgde dit ervoor dat het gehele dorsale deel van het centrale zenuwstelsel of het ruggenmerg veranderde in een dorsaal deel van het centrale zenuwstelsel of de dakplaat.

En wat dit ons vertelde, in combinatie met een reeks andere experimenten die Victor heeft uitgevoerd, was dat LMX1A op zichzelf verantwoordelijk is voor het aansturen van het volledige differentiatieprogramma van de dakplaat. Dat is belangrijk omdat de dakplaat een kritisch signaleringscentrum is in het ontwikkelende zenuwstelsel. Zonder dakplaat worden er geen morfogenen uitgescheiden om aangrenzende cellen van de neurale buis te instrueren om te differentiëren tot dorsale sensorische neuronen.

En zonder die signalen gaan die cellen over in een standaardtoestand van een intermediair celtype. Hierdoor gaat men het grootste deel van de dorsale neuronen in het ruggenmerg verliezen, maar ook in het ontwikkelende cerebellum. Ik denk niet dat we gemakkelijk tot die conclusie zouden zijn gekomen met een ander systeem dan de neurale buis van de kip.

Wij zijn zeer geïnteresseerd in de ontwikkeling van het cerebellum, niet alleen vanwege de fundamentele biologie in muissystemen en bij de kip, maar ook omdat mensen cerebrale malformaties kunnen hebben. Deze menselijke cerebrale malformaties zijn nog zeer slecht begrepen. Daarom hebben wij, in samenwerking met een collega, Dr. William Dobbins, een van de wereldexperts op het gebied van menselijke hersenmalformaties, samen een project gestart om genen die verantwoordelijk zijn voor menselijke cerebrale malformaties te identificeren.

We hanteren verschillende benaderingen. Een van de belangrijkste zaken die we hebben gedaan, is het opbouwen van een DNA-databank en een klinische databank waarin we meer dan 500 patiënten hebben geworven met gedefinieerde menselijke cerebellaire malformaties; we hebben MRI-beelden verzameld en deze gecorreleerd met DNA-monsters, zodat we dit als bron kunnen gebruiken voor het opsporen van genen. Het blijkt namelijk dat menselijke cerebellaire malformaties helemaal niet goed gecategoriseerd zijn. Eerlijk gezegd zou ik zeggen dat van elke 10 scans die we via onze studies ontvangen, er minstens één een malformatie is die nog nooit is beschreven en voorheen eigenlijk niet werd herkend.

De meest voorkomende malformatie van het menselijk cerebellum wordt de Dandy-Walker-malformatie genoemd, en dit is de vorm die door clinici het meest herkend wordt. Maar het blijkt een soort verzameldiagnose te zijn binnen de wereld van de menselijke cerebellaire afwijkingen. Veel artsen, of zelfs elke arts, classificeren een abnormaal cerebellum zodra ze dit zien als Dandy-Walker.

Daarom werven we patiënten voor ons onderzoek naar de Dandy-Walker-malformatie, waarbij we allerlei verschillende interessante cerebellaire malformaties tegenkomen. We gebruiken deze bron om nieuwe genen voor de ontwikkeling van het cerebellum te vinden, want als ontwikkelingsbioloog ben ik van mening dat mensen één groot mutagenese-experiment vormen. Zij zijn een uitstekende bron voor het ontdekken van nieuwe ontwikkelingsgenen.

We hanteren verschillende benaderingen om deze genen te vinden. Een van die benaderingen is om genen die we in de muis hebben geïdentificeerd en die een rol spelen bij de ontwikkeling van het cerebellum, in mensen te sequensen. Sterker nog, we hebben onlangs de allereerste humane LMX1A-mutatie geïdentificeerd.

Tot nu toe zijn er slechts zeer beperkte toepassingen van ons fundamentele wetenschappelijk onderzoek in het klinisch onderzoek geweest. Maar dat verandert momenteel zeer snel. Naarmate we steeds meer nieuwe genen ontdekken, kunnen we nieuwe genetische counselinginformatie verstrekken aan families van getroffen kinderen.

En eerlijk gezegd is dat waar ik de grootste impact van ons onderzoek zie. Mijn visie voor het vakgebied over vijf jaar is dat er veel meer genontdekkingen zullen hebben plaatsgevonden, zowel door karakterisering van muismodellen als door werk aan menselijke cerebellaire malformaties. We zullen meer weten over de set genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van het cerebellum.

Vervolgens zal het doel moeten zijn om te bepalen hoe deze genen met elkaar interageren en hoe deze genen de feitelijke biologie aansturen. Hoe sturen zij al de verschillende cellulaire processen aan die plaatsvinden om een cerebellum te vormen? Ik denk dat het cerebellum echt een ideaal model is voor het gehele centrale zenuwstelsel, omdat er eerlijk gezegd slechts vijf tot zeven hoofdtypen neuronale cellen zijn.

Ze zijn allemaal op een diverse stereotype wijze gerangschikt. We leren steeds meer over de moleculen die de specificatie en de vroege differentiatie van deze progenitoren aansturen. We begrijpen steeds beter hoe deze cellen prolifereren.

Ik denk dat dit meer dan vijf jaar gaat duren, maar uiteindelijk zie ik een toekomst waarin het vakgebied in staat is om de ontwikkeling van de neurale buis volledig te volgen tot aan de ontwikkeling van het cerebellum, om zo de volwassen vorm van het cerebellum te bereiken. En omdat het cerebellum een relatief simpel systeem is, hoop ik dat we daadwerkelijk de moleculen en de ontwikkelingsgebeurtenissen kunnen ontrafelen die de vorming van het gehele cerebellum aansturen. Ik geloof dat dit echt belangrijk is, niet alleen voor het vakgebied van de genetische diagnostiek bij mensen en de ontwikkeling van het cerebellum, maar ik denk dat we deze mechanismen ook kunnen toepassen op andere delen van de hersenen.

Het cerebellum is een relatief eenvoudige structuur, maar veel van de ontwikkelingsprocessen zijn niet exclusief voor het cerebellum. We kunnen de kennis die we over het cerebellum hebben opgedaan toepassen op andere, complexere regio's van het centrale zenuwstelsel, zoals de cerebrale cortex, en de lessen en signaalpaden die we hebben geleerd gebruiken om uit te zoeken hoe deze van toepassing zijn op de rest van de hersenen.