Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

Het algemene doel van het volgende experiment is om genexpressie te analyseren met behulp van functionele nucleaire machinerieën die uit cellen zijn geëxtraheerd. Dit wordt bereikt door eerst de HeLa-cellen te oogsten en te doen zwellen. Vervolgens worden de cellen gelyseerd door middel van downing en daarna gecentrifugeerd om de kernen in de derde stap te pelletteren.

De kernen worden met zout geëxtraheerd, geconcentreerd en gedialyseerd om oplosbare en functionele machineries voor genexpressie te verkrijgen. Uiteindelijk kan de functionaliteit van de nucleaire extracten worden geëvalueerd op basis van hun transcriptie- en splicingactiviteiten, beoordeeld met een gekoppeld RNA-polymerase-transcriptie- en splicing-systeem. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de preparatie van bulk-nucleaire extracten, is dat er met deze techniek een kleine hoeveelheid cellen kan worden gebruikt om het nucleaire extract te prepareren.

Begin met het uitplaten van HeLa-cellen op drie platen van 150 millimeter met DMEM-medium aangevuld met FBS en antibiotica. Laat de culturen groeien in een incubator van 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen een confluentie van 90% bereiken. Aspireer op dit punt het medium van de HeLa-celculturen en was ze eenmaal met 13 milliliter PBS op kamertemperatuur per plaat. Aspireer vervolgens de PBS. Zet elke plaat een paar seconden op zijn zijkant en aspireer de resterende PBS.

Gebruik vervolgens een cellifter om de cellen naar de onderste rand van elke plaat te schrapen en trek de cellen daarna in een eppendorfbuis van 1,5 milliliter. Pelletiseer de cellen vervolgens in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij 100 $\times$g en bij 4 °C. Aspireer nu de PBS van het cellpellet en schat het packed cell volume of PCV door naar de graduatie op de buis te kijken.

Voeg vervolgens een volume hypotone buffer toe aan het celpellet dat twee keer zo groot is als het PCV. Schud de buis voorzichtig om de cellen te resuspenderen. Pipetteer de celsuspensie indien nodig voorzichtig op en neer met een 1000 µL pipet om celaggregaten los te maken.

Pelleteer de cellen vervolgens onder dezelfde centrifugecondities als voorheen. Aspireer na centrifugatie voorzichtig de hypotone bufferlaag. De cellen zullen zijn begonnen op te zwellen en het celvolume zal zijn toegenomen tot ongeveer 750 tot 1000 microliters.

Voeg nieuwe hypotone buffer toe tot een eindvolume van 1,5 milliliters en resuspendeer de cellen in de buffer. Incubeer tenslotte de geresuspendeerde gezwollen cellen 10 minuten op ijs om de cellen te koelen. Spoel een homogenisator af met hypotone buffer en plaats deze vervolgens samen met de cellen op ijs.

Droog vervolgens de stamper met een pluisvrije doek, zoals een Kimwipe. Gebruik een verlengde micropipetpunt van 1000 microliter om de buffer uit de buis te verwijderen. Gebruik nu de pipet om de gekoelde, gezwollen cellen in de buis over te brengen.

Het meest kritieke deel van deze procedure om succes te garanderen is de controle op lysis. Bekijk na elke stap onder de microscoop. Beweeg de nauwsluitende stamper van de buis langzaam vijf keer op en neer om de cellen te lyseren, waarbij u voorzichtig bent om luchtbellen te vermijden. Draag vervolgens een volume van 5 µL van de gelyseerde celsuspensie over naar een Eppendorf-buisje en voeg 10 µL trypaanblauw en 15 µL 1X PBS toe.

Voeg de celoplossing toe aan een objectglas en onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop op lysis; de kernen van gelyseerde cellen zullen na drie passages blauw kleuren. Er is onvoldoende lysis, aangezien er talrijke levende cellen zichtbaar zijn. Na vijf passages is er voldoende lysis.

Breng tenslotte de gelyseerde cellen over naar een vooraf gekoelde Eppendorf-buis en centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten in een microcentrifuge bij 1500 ×g en vier graden Celsius. Breng vervolgens voorzichtig de supernatant over naar een nieuwe buis zonder het pellet te verstoren. Schat nu het volume van de kernfractie (PNV) door te kijken naar de schaalverdeling op de buis.

Vul een micropipetpunt met een low salt buffer tot de helft van het PNV. Plaats vervolgens de micropipetpunt in de kernen onderin de einor-buis. Spuit de buffer langzaam in de kernen terwijl u voorzichtig mengt.

Tik voorzichtig tegen de buis om er zeker van te zijn dat de pellet volledig is geresuspendeerd. Voeg vervolgens high salt buffer toe in een hoeveelheid van de helft van het PNV en meng dit snel één keer door de buis om te keren. Roteer de buis gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

CentrifugeHoud tot slot de kernen 15 minuten lang bij 18.000 ×g en 4 °C in de microcentrifuge. Begin met het overbrengen van 500 µL van het supernatant naar gekoelde micro-centrifugebuisjes. Centrifugeer het nucleaire extract met hoog zoutgehalte 15 minuten lang bij 14.000 ×g en 4 °C; keer na centrifugatie de mini-racon om en plaats deze in een nieuwe individuele EOR-buis.

Na twee minuten centrifugeren bij 1000 ×g en vier °C, zal het nucleair extract met hoog zoutgehalte geconcentreerd zijn tot ongeveer 115 µL. Breng nu aliquoten van 45 µL van het nucleair extract met hoog zoutgehalte over naar mini-dialyse SLI's. Zorg ervoor dat de onderkant van de slide in contact staat met de onderkant van de vlotter.

Plaats vervolgens de SLI's in 500 milliliters gekoelde dialysebuffer. Roer ten slotte de aliquoten gedurende één tot twee uur bij vier graden Celsius; het nucleaire extract zal na dialyse troebel verschijnen. Deze figuur toont representatieve gegevens waarin een gekoppelde RNA-polymerase II-transcriptie- en splicingreactie in een kleinschalig nucleair extract wordt vergeleken met een bulk-nucleair extract.

Wanneer het A-C-M-V-D-N-A construct werd geïncubeerd in de bulk- of kleine schaal extracten, werden soortgelijke hoeveelheden nascent pre-mRNA gesynthetiseerd tegen het tijdstip van vijf minuten na toevoeging van alpha-amanitine om verdere transcriptie te blokkeren; de splicing-intermediaten en splicing-producten accumuleerden in beide typen extracten in de loop van de tijd met een vergelijkbare kinetiek. Deze representatieve resultaten bevestigen dat de efficiënties van het gekoppelde RNA-polymerase II transcriptie- en splicing-systeem vergelijkbaar zijn in de bulk- en kleine schaal kernextracten. Om het nut van het kleine schaal extract aan te tonen, werden extracten bereid uit HeLa-cellen behandeld met de splicing-remmer E 7 1 0 7 of de negatieve controleverbinding Platyanaly F, waarna een gekoppelde RNA-polymerase II transcriptie- en splicing-assay werd uitgevoerd zoals gedemonstreerd in deze figuur; transcriptie door RNA-polymerase II vond efficiënt plaats in extracten bereid uit zowel de Platyanaly F- als de E 7 1 0 7-behandelde cellen.

Daarentegen vond splicing normaal plaats in het extract dat was bereid uit de met analy F behandelde cellen, maar was deze afwezig in de met E 7 1 0 7 behandelde cellen. Deze gegevens leveren een proof of concept voor het gebruik van nucleaire extracten op kleine schaal voor speciale behandeling van cellen op kleine schaal. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan vijf uur worden voltooid.