Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Het algemene doel van het volgende experiment is het presenteren van een robuuste preparatiemethode voor biologisch relevante lipide-vesikels. Dit wordt bereikt door fosfolipiden te mengen en over te brengen naar glazen vials en deze te hydrateren met een waterige buffer om een multilamellaire SLE-suspensie te creëren. Als tweede stap wordt een vries-dooi-methode uitgevoerd, wat vervolgens resulteert in de productie van unilamellaire vesikels vanuit multilamellaire vesikels.

Vervolgens wordt de liposoomsuspensie door een extruder geleid met gebruik van de bepaalde optimale druk om homogene lipidovesikels van een gewenste grootte te produceren. Er zijn resultaten verkregen die consistente submicron-vesikelgroottes aantonen op basis van dynamische lichtverstrooiing en nanoparticle tracking-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals sonicatie en sedimentatie, is dat deze methode gebruikmaakt van een drukregelsysteem met optimaal bepaalde stikstofstroomsnelheden voor een efficiënte bereiding van de lipidovesikelgrootte.

Om deze procedure te starten, neemt u een glazen flacon van 20 milliliter met een Teflon-gevoerde dop; reinig al het glaswerk en de spuiten vóór gebruik met chloroform om contaminatie te voorkomen. Breng 100 µL chloroform van reagentia-kwaliteit over naar de glazen flacon met een luchtdichte glazen spuit van 250 µL. Voeg 30 µL methanol van reagentia-kwaliteit toe aan dezelfde glazen flacon met een luchtdichte glazen spuit van 100 µL.

Bereid een twee millimolaire PopC-poppy-cholesterollipide-oplossing door 216 µL van 10 mg/mL PopC, 42 µL van 10 mg/mL PopE en 20 µL van 11 mg/mL cholesteroloplossing over te brengen naar een glazen flesje van 20 mL. Laat de organische oplosmiddelen verdampen met een langzame stroom argongas of stikstofgas totdat er een dunne lipidefilm op de bodem van het flesje zichtbaar is. Plaats het open glazen flesje gedurende ten minste 30 minuten in een vacuümdesiccator.

Om resterend oplosmiddel te verwijderen, brengt u twee milliliter buffer die vooraf door een 0,2 micron filter is gehaald over in het glazen vial om de lipiden te hydrateren. Incubeer het mengsel gedurende één nacht bij vier graden Celsius en gebruik dit binnen 48 uur voor liposoomgroottes van 30 tot 100 nanometer. Vries de liposoomsuspensie gedurende 15 seconden in vloeibare stikstof.

Ontdooi vervolgens de liposoomsuspensie met behulp van een warmteblok bij 42 degrees SIUs gedurende ongeveer drie minuten. Herhaal het vries-dooi-proces voor in totaal vijf cycli. Bevriezen en vervolgens ontdooien produceert Ella Les uit multilamellaire vesikels en verhoogt de efficiëntie van lipideninvanging tijdens extrusie.

Bereid vervolgens de extrusie voor door de instructies voor Avastin te volgen om de lipo so fast LF 50-extruder zorgvuldig te assembleren. Een correcte assemblage is cruciaal om stikstoflekkage te voorkomen, aangezien dit de gewenste stroomsnelheden beïnvloedt. Voer de volgende stappen zorgvuldig uit om succes te garanderen.

Om een luchtdichte afsluiting te creëren: plaats het zeefscherm met grote gaten in de basis van de ondersteuningsfilter, gevolgd door de ronde centrale schaal, één drainageschijf en één polycarbonaatmembraan. Plaats de kleine zwarte O-ring bovenop het membraan en bevestig deze aan de basis van de ondersteuningsfilter.

Bevestig de bovenste filterextruder door vier schroeven in de vier bijbehorende gaten aan te draaien. Monteer de filterextruderunit onder het grote extrudervat. Voeg de liposoomoplossing toe aan het cilindervat bovenop het extrudervat.

Plaats een grote ronde O-ring, een smalle dop, een grote ronde O-ring en een ronde dop. Bevestig de gasregelaar aan de bovenkant van de extrudervat en sluit alle afsluiters, inclusief het overdrukventiel, om luchtlekkage te voorkomen. Plaats een glazen vial van 20 milliliter of een erlenmeyer van 50 milliliter onder de filtereenheid van de extruder.

Een veiligheidsventiel is verbonden met de regelaar en zal openen als de druk 600 PSI overschrijdt. Ik zet het stikstofgas aan en open het gasventiel dat verbonden is met de extruder. Verhoog de stikstofdruk naar 25 PSI voor 400 nanometer liposomen, naar 125 PSI voor 100 nanometer liposomen, en naar 400 tot 500 PSI voor 30 nanometer liposomen. Houd de liposoomsuspensie in de gaten totdat deze, voortgestuwd door de stikstof, in de opvangbak wordt gespoten.

Blijf stikstof doorvoeren totdat er geen vloeistof meer zichtbaar is. Laat de oplossing door het extruderfilter in het glazen bestand lopen om DLS-analyse uit te voeren. Bereid eerst 50 µL van een 20 µM liposomenoplossing voor, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS.

Zet vervolgens de stroomvoorziening en de lampbron aan. Open daarna de Dynapro-software. Stel de software in op het algoritmische model om liposomen van de gewenste grootte te detecteren.

Pipetteer, na aansluiting van de hardware, 14 µL liposoommonster in de kwartsvete en plaats deze in de celhouder. Druk op start en druk na ongeveer 20 tot 30 acquisities op stop. Analyseer de gemiddelde liposoomdiameterpieken die op het histogram zijn geregistreerd. Nanopartikel-trackinganalyse begint met de bereiding van een 500 µL 0,1 µM liposoomoplossing gesolubiliseerd in PBS; spoel het monstercompartiment met water en ethanol.

Droog vervolgens het monstercompartiment af met een pluisvrije papieren handdoek. Zet de laserstroombron en de computer aan en breng 300 µL 0,1 M liposoomoplossing aan in het monstercompartiment. Open de temperatuurregeling en de software voor nanoparticle tracking analysis.

Druk op de capture-knop om de laser in te schakelen. Gebruik de horizontale en verticale verstellingen om de tafel te bewegen en de focus van de microscoop af te stellen. Stel de gewenste temperatuur en opnametijd in.

Druk op de opnameknop om gedurende een gespecificeerde tijd meerdere beeldframes van de liposoomdeeltjes vast te leggen. Analyseer de pieken die overeenkomen met de diameter van de liposomen op het histogram terwijl de beweging van elk deeltje wordt gevolgd. DLS is een gevestigde methode die verstrooid licht verzamelt om de deeltjesdiameter te bepalen en werd uitgevoerd om de grootte van de liposomen vast te stellen.

Gehydrateerde liposomen werden geëxtrudeerd door polycarbonate membranen van verschillende groottes en onder verschillende drukken, zoals beschreven in het geschreven protocol. De diameters van de liposomen gemeten via DLS bedroegen 66 ± 28 nanometer voor een poriegrootte van 30 nanometer. Voor een poriegrootte van 100 nanometer was dit 138 ± 80 nanometer, en voor een poriegrootte van 400 nanometer was dit 360 ± 25 nanometer.

Een suspensie van gepolijste Irene-beads van 50 nanometer werd gebruikt als kalibratiestandaard, waarbij een diameter van 47 ± 16 nanometer werd geregistreerd. De procentuele polydispersiteit laat zien dat er geen overlap is in de liposoomgroottes. Het is gebruikelijk om diameters groter dan 30 nanometers waar te nemen bij DLS-analyse vanwege de bekende bias van dit instrument voor grotere deeltjes.

Ondanks deze instrumentele beperking beschrijft de kalibratiecurve een lineaire correlatie. Nanodeeltjes-trackinganalyse is een nieuwe technologie die de grootte van elk deeltje meet op basis van directe observaties van diffusie in een vloeibaar medium, onafhankelijk van de brekingsindex of dichtheid van het deeltje. Deze techniek met een hoge resolutie kan worden gebruikt als aanvulling op de meting van liposomen met DLS; de NTA registreerde diameters van 95 ± 48 nanometers en 356 ± 51 nanometers voor twee polystyreenoplossingen van 100 nanometer en 400 nanometer die voor kalibratie werden gebruikt.

Lipide-oplossingen hebben een meer vergelijkbare diameter relatief aan DLS, waarbij gemiddelde groottes van 29 plus of minus 14 nanometer werden gemeten voor een poriegrootte van 30 nanometer, 95 plus of minus 17 nanometer voor een poriegrootte van 100 nanometer en 359 plus of minus 73 nanometer voor een poriegrootte van 400 nanometer. NTA kan een meer algemene karakteriseringstechniek zijn om microscopische deeltjes te kwantificeren, aangezien de gevoeligheid metingen van deeltjes van 50 tot 1000 nanometer mogelijk maakt. De kalibratiecurve vertoont een lineaire correlatie tussen de poriën van het polycarbonaatmembraan en de geregistreerde NTA-diameter. Negatief gekleurde transmissie-elektronenmicroscopische beelden laten zien dat elke liposoomgrootte na extrusie naar groottes van 3, 100 en 400 nanometer duidelijk van elkaar te onderscheiden is.

De vergroting werd ingesteld op 25.000 maal, waarbij de schaalbalk 0,5 µm vertegenwoordigt. Er werd een tijdreeksexperiment uitgevoerd met drie liposoomgroottes. DLS werd voor elke liposoomoplossing gemeten direct na extrusie.

Alle liposoomoplossingen werden gedurende de nacht bij vier graden Celsius bewaard. De diameters werden na een incubatie van een nacht opnieuw vastgesteld met DLS. Na een incubatieperiode van 60 uur werd er weinig tot geen verandering waargenomen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat meerdere passages door het extrusiefilter de homogeniteit van de liposoomoplossing verbeteren.

Vergeet bovendien niet om glazen flacons en spuiten te gebruiken voor de monstervoorbereiding om contaminatie door uitloging van polypropyleenbuizen door chloroform te voorkomen.