Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

Het doel van deze procedure is om in 3D gekweekte cellen bloot te stellen aan interstitiële vloeistofstroom en om de door de stroom gemedieerde effecten op celinvasie te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een gellopossing voor te bereiden die bestaat uit type one collagen en matrigel. De tweede stap is het toevoegen van een gespecificeerde concentratie cellen aan de gellopossing.

Vervolgens wordt de celsuspensie toegevoegd aan een transwell met een diameter van 12 millimeter en een poriegrootte van acht micron, en geïncubeerd bij 37 °C totdat de matrix stolt. De laatste stap bij het opzetten van de assay is het toevoegen van specifieke hoeveelheden medium aan de transwells om statische en flowcondities te creëren. 24 uur later worden de transwellmembranen gefixeerd, gekleurd en gevisualiseerd voor de kwantificering van het aantal geïnvadeerde cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microfluïdische interstitiële stroomkamers, is dat er geen pompen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn en dat onderzoekers meerdere condities of behandelingen eenvoudig en snel kunnen testen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in cellulaire migratie en invasie, kan ze ook worden gebruikt of toegepast om het effect van interstitiële vloeistofstroom op andere relevante cellulaire processen te bestuderen, zoals eiwitexpressie, celproliferatie en veranderingen in celsignalering. Het demonstreren van deze procedure zal een LIMA twee chaa zijn.

Een promovendus in mijn laboratorium begint deze procedure door een kleine aliquot Matrigel op ijs bij 4 °C te plaatsen. Bereid vervolgens het recept voor de gel met PBS, steriel water, natriumhydroxide, Matrigel en rattenstaart type I collageen. Meng daarna de componenten van de gel op ijs in dezelfde volgorde en laat de uiteindelijke oplossing één uur incuberen bij 4 °C.

Plaats nu met een gest steriliseerde pincet een celkweekinsert van 8 µm poriegrootte en 12 millimeter diameter in een 12-wells plaat. Tel vervolgens de cellen en resuspendeer deze in serumvrij medium op een concentratie van 5 × 10⁶ cellen per milliliter; voeg 100 µL van de celsuspensie toe aan 900 µL van de gellusolution. Meng deze daarna grondig door voorzichtig met de pipette op en neer te pipetteren.

Voeg vervolgens 150 µL van het uiteindelijke mengsel toe aan elk insert. Plaats de inserts daarna gedurende 30 minuten in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 totdat de gel gepolymeriseerd is. Voeg voor de statische conditie 100 µL serumvrij medium bovenop de gel toe en 1.200 µL onder het insert.

De vloeistofniveaus binnen en buiten de insert in de well moeten ongeveer gelijk zijn, zodat er een minimaal drukverschil over de gel ontstaat en er geen interstitiële stroom plaatsvindt. Voor de stroomconditie voegt u 100 µL van het serumvrije medium onder de insert toe en 650 µL boven de gel. Probeer tegelijkertijd te voorkomen dat er luchtbellen onder de insert ontstaan, aangezien deze zullen belemmeren dat cellen op die locaties door het membraan migreren.

Plaats de plaat vervolgens gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C met 5% carbon dioxide. Voeg in deze stap 500 µL van één keer PBS per put toe aan een nieuwe 24-wells plaat om de inserts te wassen. Verwijder daarna het medium dat nog over is in het bovenste gedeelte van de flow trends-putsjes.

Verwijder vervolgens de gel van de inzetten met wattenstaafjes. Veeg het bovenoppervlak van het membraan schoon om niet-VA-cellen te verwijderen. Was daarna de inzetten door ze gedurende 15 seconden in de 24-wells plaat met 1× PBS te plaatsen.

Verwijder daarna de PBS en voeg 500 µL 4% paraformaldehyde toe onder elk insert. Incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de getransmigreerde cellen te fixeren. Verwijder vervolgens de PFA en spoel ze eenmaal met 500 µL PBS om het resterende fixatief te verwijderen.

Voeg vervolgens 500 µL 0,5% Triton X 100-oplossing onder de inserts toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de cellen te permeabiliseren, snijdt u de membranen uit de insert met een scheermesje. Plaats ze vervolgens in 100 µL 2 µg/mL DPI in een 1× PBS-oplossing.

Zorg ervoor dat de onderzijde van het membraan naar beneden is gericht. De DPI-oplossing moet enkele minuten voor gebruik worden bereid en in het donker worden bewaard. Wikkel de plaat nu in aluminiumfolie.

Plaats het op een schudplaat bij 150 RPM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de membranen één keer in 500 µL PBS en plaats ze opnieuw op de schudplaat voor 10 minuten. Herhaal de wasstap nog twee keer om vrij jy te verwijderen.

De volgende stap is om de membranen op glazen objectglaasjes te plaatsen met de getransmigreerde cellen naar boven gericht. Voeg monteersolution toe aan de membranen. Dek ze vervolgens af met dekglasjes.

Tel vervolgens de DAPI-kleuring van de kernen en bereken het aantal geïnvadeerde cellen volgens het bijbehorende manuscript. Deze figuur toont de getransmigreerde MDA-MB-435-cellen op het membraan. De geïnvadeerde cellen werden gefixeerd na de interstitiële vloeistofstroom-invasie-assay en gekleurd met DPI en Alexa Fluor 488-geconjugeerd phalloidine om het tellen van de geïnvadeerde cellen te vergemakkelijken.

Dit is het membraan onder helderveldmicroscopie en hier zijn de met DAPI gekleurde kernen. De met Alexa Fluor 488 gefixeerde F-actine kleuringen worden hier getoond. Deze grafiek laat zien dat de invasie van MDA-MB-435 metastatische melanomcellen significant werd versterkt door interstitiële stroming.

Na 24 uur worden de resultaten genormaliseerd naar het gemiddelde van de statische invasieconditie en wordt het gemiddelde van zes celkweekinserts gepresenteerd. Het verschil tussen de condities is statistisch significant met een P-waarde van 0,003. Zodra de methode onder de knie is, kan de assay voor interstitiële vloeistofstroom in twee uur worden opgezet, gevolgd door een incubatie van 24 uur en vervolgens twee uur voor het fixeren en kleuren van de Transwell-membranen.

Na deze procedure kunnen cellen, eiwitten of nucleïnezuren eenvoudig worden geëxtraheerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de gen- en eiwitexpressie verandert als reactie op interstitiële vloeistofstroom. Sinds de ontwikkeling hiervan is dit een essentiële assay geworden voor onderzoekers die de effecten van interstitiële stroom op kankercellen bestuderen.