Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Het algemene doel van het volgende experiment is het genereren van muizen met een gemanipuleerd menselijk immuunsysteem. Dit wordt bereikt door in de eerste stap de muis voor te bereiden op de chirurgische ingreep en in de tweede stap de trocart te vullen met een stukje thymus. Matrigel wordt gemengd met CD 34 negatieve en CD 34 positieve getransduceerde cellen, waarna het mengsel aan de trocart wordt toegevoegd.

Vervolgens worden de matrigel-constructen onder het nierkapsel getransplanteerd. Uiteindelijk kan de afstoting van de doeltumoren door de genetisch gemodificeerde CD8 T-cellen worden gemonitord via live PET-imaging en fysieke tumormetingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals volledige neuron-modellen, is dat deze methode de studie van de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde menselijke stamcellen binnen de menselijke thymus mogelijk maakt, gevolgd door in vivo-effectiviteitstesten van de afgeleide lineages; de procedure zal worden uitgevoerd door drie technici uit onze laboratoria: Gregory Bristol, Bernard Levin en Sean Kim.

In dit schema wordt het gemodificeerde BLT-model beschreven dat in deze studies is gebruikt voor de generatie van chimere muizen met mart1-specifieke T-cellen. Het thymusimplantaat wordt gereconstrueerd uit getransduceerde en niet-getransduceerde CD34-cellen die zijn geïsoleerd uit een autologe foetale lever. Een fractie van de getransduceerde cellen wordt vervolgens ingevroren en vier tot zes weken later geïnjecteerd in de bestraalde muizen.

In deze video wordt de implantatie van het levende construct gedemonstreerd zodra de dieren loom zijn geworden door de anesthesie. Begin met het scheren van de linkerkant van elke muis van de heup tot de schouder, tussen het midden van de rug en de buik. Noteer het gewicht van elk dier, nummer de dieren door gaatjes in de oren te ponsen en injecteer subcutaan 0,3 milliliter carprofen in elke schouder.

Leg de muizen vervolgens op hun rechterzij, met het gezicht naar links. Spoel nu de trocar van een 16 gauge kankertransplantatienaald met een ronde vijltip met PBS. Voeg met een spitstang een stukje thymus toe aan het schaaltje met PBS en houd vervolgens de trocar horizontaal met de staaf.

Aspireer het weefsel net binnen de punt. Het schuiven van de trocar onder het nierkapsel en het injecteren van het weefsel is een van de meest uitdagende aspecten van deze procedure. Schakel vervolgens een assistent in.

Gebruik een pipette met positieve verplaatsing om vijf µL koud Matrigel met voorzichtig roeren te mengen in één buis met cellen. Houd de trocart horizontaal. Trek de staaf langzaam terug terwijl de assistent het Matrigel pipetteert.

Meng dit in de trocart voor elke muis. Veeg eerst de blote huid van het dier af met Betadine en reinig deze vervolgens met een isopropanoldoekje. Bepaal twee keer het donkerste punt onder de huid, wat de locatie van de milt aangeeft.

De nier bevindt zich ongeveer vijf millimeter dorsaal van de milt; gebruik stompe pincetten om de huid over de nier op te tillen. Maak een incisie van ongeveer 15 millimeter in de huid, parallel aan de milt. Maak een soortgelijke incisie in de onderliggende spierlaag van het peritoneum.

Bij mannetjes zou de nier direct zichtbaar moeten zijn. Knijp simpelweg in het abdomen om deze naar buiten te duwen. Houd bij vrouwtjes met de linkerhand druk uit op het abdomen om de nier blootgesteld te houden; gebruik eerst een hemostat om de eierstok op te pakken en trek vervolgens de nier naar buiten om te helpen het orgaan buiten het lichaam te houden.

Maak een klein gaatje in het posterieure uiteinde van het nierkapsel en schuif vervolgens de trocart in dit gaatje en langs de nier totdat de opening van de trocart volledig wordt bedekt door het nierkapsel. Injecteer vervolgens het weefsel met de pink van de rechterhand. Gebruik nu de gesloten hemostaat om de nier voorzichtig terug op zijn plaats te duwen.

Zet één hechting in het peritoneum met een dubbele strik, waarbij de huid als een purse-string wordt samengeknepen, en bevestig deze vervolgens met twee wondclips. Breng tot slot een druppel PBS aan op elk oog en leg de muis op haar zij in een kooi op wat bodembedekking. Nadat alle muizen op dezelfde wijze zijn geïmplanteerd, dient te worden bevestigd dat de dieren weer op hun buik liggen voordat ze worden achtergelaten.

Deze eerste figuur toont een representatieve afbeelding van het THI-live-implantaat in gehumaniseerde muizen. In deze figuur wordt de normale ontwikkeling van het thymisch weefsel en de fysiologische weefseldistributie van de menselijke CD4- en CD8-positieve T-cellen gedemonstreerd. Na reconstitutie beschikken de dieren over een menselijk immuunsysteem met een normale distributie van CD4- en CD8-positieve T-cellen.

Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van een muis met een melanoomtumor. De grijze gebieden geven het CT-scanbeeld weer. De gekleurde gebieden geven de metabole activiteit van de tumor aan, zoals gedetecteerd door de PET-scan.

De CT-scan alleen wees in dit experiment op een grote tumormassa in het gebied dat door de witte cirkel is aangegeven. Echter, zoals de in vivo PET-beeldvorming illustreert, bestaat dit gebied grotendeels uit necrotisch weefsel en littekenweefsel, wat het nut van PET-beeldvorming onderstreept als een gevoeligere en nauwkeurigere methode om tumorgressie en klaring te beoordelen. Na deze procedure kunnen andere assays, zoals T-cel-fenotypering en ex vivo activatie, worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden die relevant zijn voor de T-cel functie.