Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een populatie gezuiverde neuronale progenitorcellen uit ganglia van het perifere zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst het orgaan of de specifieke ganglia van belang te dissekeren uit foetale muizen. De weefsels worden vervolgens gedeeltelijk gedissocieerd om de individuele cellen vrij te maken in het omringende medium.

Vervolgens wordt de cel-suspensie gefilterd om eventuele resterende weefselklonters of grote aggregaten te verwijderen. Ten slotte wordt de cel-suspensie via flowsorting gesorteerd om de gewenste populatie te isoleren op basis van de expressie van een fluorescente reporter in die celpopulatie. Uiteindelijk kunnen genexpressiepatronen worden vergeleken tussen progenitoren, geïsoleerd in verschillende ontwikkelingsstadia, of tussen gezuiverde populaties van verschillende neuronale celtypen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de isolatie van celpopulaties op basis van antilichaamlabeling is dat immuno-reagentia vaak niet beschikbaar zijn. Genetisch gemodificeerde muizenlijnen die fluorescerende eiwitten produceren in specifieke neuronale subsets maken de isolatie van deze celpopulaties mogelijk, waarbij cellen die een specifiek gen tot expressie brengen, worden gelabeld. Hoewel we deze methode demonstreren voor de isolatie van neurale progenitoren uit de darm en het neurogene traject van de mond, kan deze ook worden toegepast op andere modelsystemen die fluorescerende reporters tot expressie brengen.

Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze methode moeite omdat ze de neiging hebben het bronweefsel te overdigesteren, wat leidt tot een verlies van celviabiliteit. Bekijk de embryo's vóór aanvang van de dissectie onder brightfield-verlichting om er zeker van te zijn dat de relevante structuren in focus zijn. Identificeer vervolgens de transgene positieve embryo's door te screenen op expressie van de fluorescerende reporter met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop.

Na de euthanasie worden de embryo's voorbereid door een minimale hoeveelheid PBS aan het dissectieschaaltje toe te voegen, zodat het embryo niet blijft drijven terwijl de weefsels worden gedissecteerd. Open de huid van het embryo langs de zijkanten van het lichaam en over het abdomen ter hoogte van de lever. Rol het embryo op zijn rug en gebruik fijne pincetten om het op zijn plaats vast te pinnen.

Plaats op het niveau van de voorpoten een tweede paar pincetten ter hoogte van het diafragma en trek vervolgens vlot de inwendige organen in de richting van de staart en weg van de dorsale lichaamswand om de viscera van de lever tot aan de genitalieknop te verwijderen. Indien er organen uit de borstholte, zoals het hart of de longen, samen met de viscera mee komen, verwijder deze dan voordat u verder gaat.

Zodra de abdominale viscera van het karkas zijn gescheiden, plaatst u een pincet onder de lever, nabij de maag, en scheidt u de lever voorzichtig van de darm. Disseceer vervolgens zorgvuldig de achterdarm weg van de dorsale urethra en verwijder de darm uit het urogenitale stelsel. Draai tot slot de darm om zodat de milt onder de maag zichtbaar wordt.

Verwijder de milt en de pancreas. Trek de darmlussen uit elkaar door het mesenterium vast te houden. Strip vervolgens het mesenterium en de bijbehorende vasculatuur van de darm door voorzichtig aan het mesenterium te trekken.

Vermijd het direct vastpakken van de darm met de pincet. Als de darm scheurt, kunnen de afzonderlijke stukjes tijdens de dissociatiefase simpelweg worden samengevoegd. Voeg elk weefseltype samen in een conische buis van 15 milliliter met ijskoud HBSS, gesorteerd op weefseltype en embryo-fenotype.

Na het centrifugeren wordt zoveel mogelijk HBSS uit de gesubdissecteerde weefsels geaspireerd. Resuspendeer vervolgens de weefselpellet in één tot enkele milliliters ACU max. Vervang de pipetpunten tussen elk monster.

Om kruiscontaminatie van weefseltypen te voorkomen, worden de buisjes 20 tot 45 minuten in een waterbad van 37 °C geplaatst. Afhankelijk van het stadium van het te isoleren weefsel is de dissociatie en filtering van het weefsel het meest kritieke deel van de procedure om overmatige dissociatie van het weefsel en bijgevolge een lage cellevensvatbaarheid te voorkomen.

Beperk de dissociatietijd en probeer halverwege niet om alle weefselstukjes volledig te dissociëren. Breek aan het einde van de dissociatietijd het weefsel handmatig op door de buis krachtig tegen de wand van het waterbad te tikken en de buis met een snappende polsbeweging naar beneden te zwaaien. Verplaats de gedissocieerde monsters nu naar ijs en voeg onmiddellijk één milliliter vers bereide quench toe aan elke buis met een nieuwe pipetpunt per monster; pipetteer het monster op en neer tot het weefsel bijna volledig is gedissocieerd.

Plaats nu met een paar met ethanol gesteriliseerde pincetten een vierkant van 38 micron nylon gaasmembraan van drie centimeter over de opening van een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Gebruik vervolgens smalle pipetpunten om de individuele resuspendeerde celoplossing door het gaas te filteren door deze in het midden van het membraan te pipetteren. Zodra de celsuspensie is gefilterd, spoelt u de monsterbuis met één milliliter quench één tot vijf en filtert u alle overgebleven cellen.

Verwijder vervolgens het membraan en let er op dat er geen ongefilterde weefselmonsters in de buis terechtkomen. Aspireer na het pelleten de supernatant van de cel-suspensies en resuspendeer het pellet in één milliliter quench één tot vijf. Filter vervolgens elke cel-suspensie door een nylon gaas in polystyreen buizen van vijf milliliter, zoals zojuist getoond.

Begin met het apart houden van een kleine aliquot van het fluorescentiemonster voor de EGFP-alleen compensatiecontrole. Verdeel vervolgens het weefselmonster van het wildtype in twee delen en label deze als wildtype-alleen en seven A a d-alleen. Vul nu alle monsterbuisjes met quench 1 tot 5 en aspireer, na het centrifugeren van de monsters, al het supernatant behalve de laatste 200 µL in elk buisje.

Voeg ten slotte zeven a a d toe aan de te sorteren monsters en aan de controle met uitsluitend zeven a a d. Voeg vervolgens 0,75 milliliters triazole LS toe aan 1,5 milliliter microcentrifuge-monsterafnamebuisjes. Begin met het gebruik van de controlemonsters om de compensatieparameters en gates in te stellen, zodat zeven A a D-positieve dode cellen worden uitgesloten en cellen met een hoge intensiteit van GFP-fluorescentie worden verzameld.

Nadat de compensatieparameters zijn ingesteld, wordt gestart met het sorteren bij de laagst mogelijke druk met een nozzle met een wijde opening en een lage stroomsnelheid. Verzamel maximaal 25 000 cellen in elke microcentrifugebuis, zodat de triol LS niet te sterk wordt verdund. Vortex direct na het sorteren elke buis met cellen die zijn opgevangen in de triol LS.

In deze eerste figuur wordt een volledige mount van het genitaliatractus van een embryo op 15,5 dagen na de bevruchting getoond, van ventraal bekeken onder lichtveldverlichting. Hetzelfde monster is afgebeeld onder fluorescentieverlichting om de distributie van EGFP-positieve cellen in de bijnier en de mediaal gelegen coeliacusganglia aan te tonen, geïdentificeerd door hun TH EGFP-transgeenexpressie. Dit zijwaartse uitzicht van een op 15,5 dagen na de bevruchting TH EGFP gesubdisseceerde blaas toont fluorescentie door transgeenexpressie in de pelvische ganglia, de blaaswand en de urethra.

In dit dorsale aanzicht van hetzelfde weefsel zijn EGFP-positieve cellen duidelijk zichtbaar in de anteriore dorsale urethra. Het dissocieren van weefsel om cel-suspensies te produceren voor flow sorting is een delicate balans tussen adequate enzymatische digestie en het vermijden van overdigestie, wat kan leiden tot een lage celviabiliteit. Deze fotomicrografieën tonen weefsels van het lagere urogenitale stelsel en de darmen halverwege de dissociatietijd. Zoals te zien is in deze foto's van adequaat gedigesteerd weefsel vóór en na handmatige fragmentatie, zijn stukjes van gesubdissecteerde organen nog steeds duidelijk zichtbaar in weefsels die te lang of met een te hoge enzymconcentratie enzymatisch zijn behandeld.

De resulterende suspensie bevat echter geen residuele grote stukken weefsel; een passende dissociatie en handmatige filtering resulteren in flowcytometrie-profielen die doorgaans meer dan 90% levensvatbare cellen vertonen. Voor de cellen die de reporter in deze levensvatbare populatie tot expressie brengen, behouden de cellen een hoge intensiteit van EGFP-expressie. De zwarte populatie bestaat uit enkelvoudige cellen die dood zijn en zijn gelabeld door de opname van 7-AAD fluorescentiekleurstof. De grijze populatie bestaat uit enkelvoudige cellen op basis van forward en side scatter die 7-AAD hebben uitgesloten en derhalve levensvatbaar zijn.

De groene populatie is afkomstig uit het gesegmenteerde GFP-positieve gebied en bestaat uit enkelvoudige levensvatbare cellen die zeven A a d hebben uitgesloten en die EGFP-fluorescentie vertonen. Met deze procedure kan de isolatie van neuronale progenitorcellen uit andere perifere weefsels, zoals de sympathische keten, de dorsale wortelganglia of de long, worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over verschillen in genexpressieprofielen tussen populaties of over de ontwikkeling van verschillende lineages.