Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Het algemene doel van het in deze video gedemonstreerde experiment is om vast te stellen of het antimicrobiële peptide lyine een rol speelt bij de verlichting van dextransulfaat-geïnduceerde colitis bij muizen. Dit wordt bereikt door beenmerg van wildtype muizen te injecteren in bestraalde wildtype en knockout-muizen, en beenmerg van knockout-muizen in bestraalde wildtype muizen. Het getransplanteerde beenmerg zal nieuwe bloedcellen genereren in de ontvanger met het genotype van de donor.

De ontvangende muizen worden vervolgens na vier weken blootgesteld aan dextraansulfaat om colitis op te wekken. Een succesvolle transplantatie wordt gevalideerd via flowcytometrie en beschadiging van het colonweefsel wordt beoordeeld via histologie. De resultaten laten zien dat colitis wordt verlicht wanneer wildtype beenmerg wordt getransplanteerd in knockout-muizen.

Omgekeerd wordt colitis verergerd wanneer knockout-beenmerg wordt getransplanteerd in wild-type muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen om vast te stellen of genexpressies afkomstig zijn uit cellen afgeleid van het beenmerg of uit cellen die niet uit het beenmerg afkomstig zijn bij ontsteking of infectie. C 57, black six, wild-type en C-eliciteerde knockout-muizen worden aanbevolen voor dit experiment om het mogelijk te maken de wild-type muizen en de knockout-muizen te volgen.

Donorencellen na beenmergtransplantatie. Gebruik CD 45.1 muizen om wildtype muizen te representeren en CD 45.2 voor de knockout-muizen. Het hier getoonde schema beschrijft de experimentele opzet waarbij vijf donor-muizen en 10 ontvanger-muizen per groep zijn toegewezen.

Voor groepen A en B wordt beenmerg getransplanteerd van wildtype muizen naar knockout-muizen. Colitis wordt geïnduceerd in groep A, maar niet in groep B. Voor groep C en D wordt beenmerg getransplanteerd van de knockout-muizen naar de wildtype-muizen, waarbij colitis alleen in groep C wordt geïnduceerd. Voor E en F vindt de transplantatie plaats van wildtype naar wildtype en voor groepen G en H vindt de transplantatie plaats van knockout naar knockout. Om donorbeenmerg voor te bereiden voor overdracht naar bestraalde muizen, begint u met het extraheren van beenmerg uit de botten van geofferde muizen in een veiligheidskast.

Gebruik steriele dissectie-instrumenten om de humerus, femur, tibia en fibula vrij te maken van aanhechtende spieren en ligamenten en breng deze over naar een Petrischaal. Snijd beide uiteinden van de botten open om het rode beenmerg zichtbaar te maken. Pak vervolgens een van de botten vast met een pincet.

Spoel het rode beenmerg uit met koud PBS met een spuit van drie milliliter en naalden van 25 gauge in een andere petrischaal. Spoel vervolgens het bot vanaf de andere kant om meer beenmergcellen te verkrijgen. Herhaal dit proces voor elk van de botten.

Combine het beenmerg van wild-type en knock-out muizen afzonderlijk. Gebruik een spuit van zes milliliter met een naald van 18 gauge en een halve inch om de rode beenmergpluggen te breken door herhaaldelijk aspireren en uitstoten. Gebruik vervolgens een serologische pipette om het verzamelde beenmerg over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter.

Zodra al het beenmerg is overgebracht, wordt het beenmerg gecentrifugeerd bij 740 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer het pellet door vijf tot 10 seconden te vortexen. Voeg vijf milliliter van een XRBC-lysebuffer per donormuis toe aan het pellet, vortex opnieuw gedurende vijf seconden en incubeer precies drie minuten bij kamertemperatuur.

Voeg na drie minuten 20 milliliters koude PBS toe aan elke buis en meng door omkeren om de lysis te stoppen. Giet vervolgens de inhoud door een 40 micron cell strainer in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Spoel de oorspronkelijke buis met vijf milliliters PBS en breng de oplossing over naar de cell strainer.

Ga door met het opvangen van de doorstroom in de conische buis. Vul het volume vervolgens aan tot 50 milliliters met PBS en meng door inversie. Bepaal daarna het aantal levensvatbare cellen via trypan-blauw-uitsluiting met behulp van een hemocytometer.

Zodra het celgetal is bepaald, worden de beenmergcellen vijf minuten gecentrifugeerd bij 913 ×g bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren het supernatant op basis van het totale celgetal. Resuspendeer de pellet in PBS tot een concentratie van 1 × 10⁸ cellen/mL.

De beenmergcellen zijn nu klaar voor overdracht naar bestraalde ontvanger-muizen. De wildtype en knockout ontvanger-muizen voor dit experiment zijn bestraald met 1000 rad zoals beschreven in het bijbehorende document; de muizen zijn gefokt en gehuisvest in een pathogenvrije faciliteit. Vier tot 24 uur na de bestraling werden de ontvanger-muizen opgewarmd op een warmtemat onder een warmtelamp om het donorbeenmerg te kunnen injecteren. Plaats een ontvanger-muis in een fixatieapparaat en veeg de staart af met 70% ethanol om de injectieplaats te steriliseren en lokale vasodilatatie te bevorderen voor een gemakkelijke injectie.

Inject met een insulinespuit met een naald van 28,5 gauge 1 × 10⁷ cellen in 1 tot 200 µL in de staartvene van elke muis na injectie. Plaats de muis gedurende de eerste vier weken na injectie in een kooi met maximaal drie andere geïnjecteerde muizen. Huisvest de geïnjecteerde recipientmuizen in geautoclaveerde kooien met water dat het antibioticum sulfa trim bevat.

Dit geeft de dieren de tijd om hun immuniteit te herstellen; vervang de kooien, het met antibiotica behandelde water en het voer elke vier dagen om de hygiëne te waarborgen. Schakel vier weken na de bestraling en beenmergtransplantatie over op gewoon water zonder antibiotica en houd de muizen nog twee weken vast om hun normale darmmicroflora te herstellen. Meet zes weken na de beenmerginjectie het initiële lichaamsgewicht om colitis te induceren.

Geef de muizen in de colitis-experimentele groep 5% dextraansulfaat in het drinkwater. Vijf dagen later wordt het perifere bloed van vier muizen verzameld in vacutainer-buisjes met een heparinecoating en op ijs geplaatst. Combineer vervolgens in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter 300 microliter bloed met 300 microliter celkleuringsbuffer en verdeel het bloed op ijs in vijf flowcytometrie-testbuisjes, genummerd één tot vijf, met elk 100 microliter.

Meet na het opofferen van de muizen opnieuw het lichaamsgewicht en bereken het verschil. Dissekeer het colonweefsel en plaats dit in formaline voor H&E-kleuring. Win vervolgens het beenmergcellen op zoals eerder beschreven.

Verdeel het resuspendeerde beenmerg over vijf microcentrifugebuisjes, gelabeld één tot vijf, met elk 100 milliliters. Ter voorbereiding op de analyse via flowcytometrie wordt het antilichaammengsel voor elk respectievelijk buisje in het donker bereid zoals beschreven in het bijbehorende document; bloed- en beenmergmonsters gelabeld met nummer één dienen als controles en worden niet gekleurd. Bloed- en beenmergmonsters gelabeld met nummer twee worden gekleurd met fitzy isotype controle PE isotype controle en CD 16/32 blockeringsoplossing.

Deze isotype-controles worden gebruikt om de specificiteit van de binding van het primaire antilichaam aan de monsters te bevestigen. Het monster met nummer drie wordt gekleurd met FZ CD 45.1 en CD 16/32. De monsters met blokkeeroplossing die zijn gemarkeerd met nummer vier worden gekleurd met CD 45.2 en CD 16/32.

Blokkeeroplossing. Labeling met een enkele kleur kan de aanwezigheid van donor- of recipiëntcellen in het bloed of beenmerg onthullen. Duidelijk gemarkeerde monsters nummer vijf worden gekleurd voor CD 45.1, CD 45.2 en CD 16/32.

Blokkering hier van de dubbele kleurmarkering toont de relatieve ratio van donor- en recipiëntcellen in het bloed of het beenmerg. Voeg vijf µL van antilichaammengsel twee en vijf toe aan hun respectieve monsterbuisjes. Voeg vervolgens drie µL van antilichaammengsel drie en vier toe aan hun respectieve monsterbuisjes.

Incubeer alle buisjes gedurende 30 minuten op ijs. Voeg na de incubatie twee milliliter XRBC-lysisbuffer toe aan elke buis. Incubeer de monsters vervolgens nogmaals 15 minuten op ijs in het donker.

Centrifugeer de cellen bij 350 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het pellet in het donker met 500 µL celkleuringsbuffer. Vortex vervolgens kort.

Voer vervolgens flowcytometrie uit op de immunogekleurde bloed- en beenmergmonsters. Selecteer FZ om wildtype CD 45.1 weer te geven en PE om knockout CD 45.2 weer te geven. Analyseer de resultaten van de flowcytometrie met de software van FloJoe.

Bereken de ratio van fit E ten opzichte van de PE-ratio of de PE-ratio ten opzichte van de fit e-ratio om te bepalen of het donorgenotype het dominante genotype is in bloed en beenmerg. Deze afbeelding toont representatieve H&E-beelden van colons met een normale histologie en DSS-colitis. Histologiebeelden worden gescoord op basis van mucosale weefselschade en neutrofieleninfiltratie in het mucosale en submucosale weefsel.

Zo wijst een hogere histologiescore op een ernstigere colitis om te testen of lyin een rol speelt bij de preventie van colitis. Beenmerg werd uitgewisseld tussen wild-type en knockout-muizen zoals beschreven in deze video. De histologie werd vervolgens geëvalueerd en gescoord zoals hier getoond.

De histologiescores waren significant verhoogd wanneer knockout-muizenbeenmerg werd geïntroduceerd in bestraalde wild-type muizen. Omgekeerd waren de scores significant verlaagd wanneer wild-type beenmerg werd geïntroduceerd in knockout-muizen. Deze gegevens geven aan dat endogeen C uit beenmerg-afgeleide cellen ontstekingsremmende effecten heeft en colitis verbetert om te verifiëren dat de transplantatie in deze muizen succesvol was.

Flowcytometrie werd ook uitgevoerd op het beenmerg en bloed van de muizen na transplantatie. Wild-type beenmerg kleurt sterk voor Fitz CD 45.1 maar niet voor PE CD 45.2 zoals hier getoond; knockout beenmerg kleurt sterk voor PE maar niet voor Fitz zoals hier getoond. Na transplantatie kleurden echter zowel het beenmerg als het bloed van wild-type muizen die knockout beenmerg hadden ontvangen sterk voor PE maar niet voor Fitz, wat aangeeft dat de dominante populatie gekleurde cellen afkomstig was van de donor.

Hetzelfde gold voor het beenmerg en bloed van knockout-muizen die wildtype beenmerg ontvingen; deze vertoonden een sterke kleuring voor fitzy maar niet voor pe, wat opnieuw bevestigde dat de overheersende gekleurde populaties van donorherkomst waren. Na het bekijken van deze video zou u in staat moeten zijn om een beenmergtransplantatie-experiment uit te voeren en colitis kunnen modificeren via beenmergafgeleide cellen.