Het overbruggen van de Bio-elektronische interface met Biofabrication

Het algemene doel van het volgende experiment is om biopolymeerfilms elektrisch neer te slaan en deze te functionaliseren met biologische componenten, zoals eiwitten en cellen. Elektrodepositie wordt bereikt door gebruik te maken van de pH-verandering die lokaal optreedt bij een onder spanning staande elektrode in combinatie met een pH-responsieve polysaccharide-oplossing. Na het kiezen van een kathodische of anodische depositiestrategie wordt de elektrode onder spanning gezet om een sol-gel-overgang te triggeren, waardoor een dunne film wordt gegenereerd met een patroon dat wordt bepaald door de elektrogeometrie.

Bovendien kunnen biologische componenten, zoals eiwitten en cellen, gedurende het proces van elektrodepositie worden geïntroduceerd. Om de film biologisch te functionaliseren, zijn resultaten behaald die via fluorescentiebeeldvorming aantonen dat de biologische componenten in de films zijn gelokaliseerd. Daarnaast zijn de componenten functioneel en in staat om met hun omgeving te interageren, wat is aangetoond door elektrochemische detectie van enzymatische activiteit en het gebruik van de respons van reportercellen.

Biofabricage biedt een innovatieve gereedschapskist voor het bouwen van de interface tussen biologie en elektronica. Wij geloven dat de belangrijkste voordelen de eenvoud zijn en het vermogen om assemblage uit te voeren onder bijna fysiologische omstandigheden. De biologie is deskundig in fabricage op nanoschaal via zelfassemblage en enzymatische weg. Door gebruik te maken van deze vermogens omzeilen we complexe, gevaarlijke en tijdrovende synthesemethoden die bij andere assemblage-technieken worden gebruikt.

Ons collaboratieve team kwam op het idee om de interface van het BioD-apparaat te bouwen met biologische materialen en mechanismen toen we observeerden dat kitan via elektroden kon worden gedeponeerd. Kitan is een pH-responsieve, filmvormende polysaccharide die door het apparaat opgelegde elektrische signalen kan herkennen en zich als een dunne film kan afzetten. Toen we zagen dat kitan via elektroden kon worden gedeponeerd, beseften we dat we toegang hadden tot een bredere set instrumenten uit de biochemie en moleculaire biologie om een interface voor het BioD-apparaat te bouwen.

De toepassing van deze techniek strekt zich uit tot lab-on-a-chip-instellingen waar functionele biologische componenten vereist zijn, aangezien ze een goedkope en eenvoudige manier bieden om dergelijke componenten te lokaliseren op een elektrode waar ze levensvatbaar kunnen blijven. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien een bio-gefabriceerde film fragiel kan zijn en gemakkelijk beschadigd kan raken. Daarom moet men voorzichtig zijn om niet te hardhandig te zijn tijdens het wassen of het afspoelen van de film.

Aangezien de film gemakkelijk verstoord kan worden, is dit een nadeel. Een voordeel is echter dat de elektroden hergebruikt kunnen worden omdat de film eenvoudig verwijderd kan worden. Om dit protocol te starten, sluit u een voeding aan op de op maat gemaakte elektroden via patchkabels met krokodillenklemmen.

Een glazen objectglas bedekt met indiumtinoxide (ITO) dient als anode of werkelektrode; platinafolie dient als kathode of tegenelektrode. Positioneer de elektrode zodanig dat het te functionaliseren ITO-oppervlak tegenover de tegenelektrode staat, waarbij het ITO-oppervlak ofwel verticaal is geplaatst om in de oplossing te worden gedompeld, of horizontaal, zodat de oplossing op het oppervlak kan worden vastgehouden. Bereid vervolgens een alginaat-depositieoplossing door 1% alginaat en 0,5% calciumcarbonaat in gedestilleerd water te mengen en het mengsel te autoclaveren. Label het alginaat vervolgens fluorescent met Fluorspheres door middel van mengen en vortexen.

Dit maakt fluorescentie-imaging van de resulterende film mogelijk. Dompel na het autoclaveren beide elektroden onder in de bereide depositie-oplossing en breng gedurende twee minuten een constante stroomdichtheid van 3 A/m² aan. Het voltage zal verschuiven in het bereik van 2 tot 3 V. Koppel na twee minuten de elektrode los en verwijder de resterende depositie-oplossing. Spoel de film voorzichtig met natriumchloride om overtollig alginaat te verwijderen.

Incubeer de film kort in 0,1 molair calciumchloride om de gel te verstevigen. De film wordt vervolgens geïncubeerd in de gewenste bewaaroplossing. Beeld de film vervolgens af met fluorescentiemicroscopie voorafgaand aan de co-depositie.

Kweek een signaalzender-celcultuur en een signaalontvanger-celcultuur volgens de instructies in het schriftelijke protocol dat bij deze video is gevoegd. Bereid vervolgens een depositieoplossing van alginaat en calciumcarbonaat. Meng de oplossing met elke celcultuur in een verhouding van één-op-één tot een eindconcentratie van 1% alginaat en 0,5% calciumcarbonaat, waarbij de cellen zijn verdund tot ongeveer de helft van de kweekdichtheid.

Gebruik een glazen objectglas voorzien van twee ITO-elektroden, begrensd door een polydimethysilaan-kuiltje, en een platina tegenelektrode. Verbind één ITO-elektrode en de platina elektrode met een spanningsbron. Dompel de elektroden, zoals voorheen, onder in de depositie-oplossing die de ontvangercellen bevat.

Stel de voeding in op een constante stroom met een dichtheid van drie ampère per meter vier, waarbij de afmeting van het oppervlak wordt bepaald door de enkele elektrode waarop de depositie plaatsvindt. Breng de stroom gedurende twee minuten toe om de codepositie van de cellen in de alginaatmatrix mogelijk te maken. Spoel de film af met natriumchloride zoals voorheen en verplaats de anodeverbinding naar de aangrenzende ITO-elektrode.

Herhaal de depositieprocedure, maar voeg deze keer de oplossing met de zendercellen toe. Incubeer de twee-elektrode chip met de co-gedeponeerde cellen en calciumargenat een nacht lang bij 37 °C in fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Aangevuld met 10% LB-medium en één millimolaire calciumchloride. Na incubatie wordt de chip gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop om te beginnen met de depositie van de chitosan-elektrode. Sluit de voeding aan op de elektroden.

Bevestig de krokodillenklemmen. Een goudgecoate siliciumchip dient als kathode en een platinafolie dient als anode. Positioneer het goudoppervlak van de elektrode zodanig dat deze de tegenelektrode tegenover staat, zoals eerder beschreven.

Bereid een Kato-zandoplossing door Kato-zandvlokken te mengen met water en langzaam twee molair zoutzuur toe te voegen om de polysachariden op te lossen. Volgens de in de tekst beschreven procedure kan de Kato-zandoplossing fluorescent gelabeld worden om de op de elektrode neergeslagen film via fluorescentiemicroscopie te visualiseren. Plaats vervolgens de elektroden in de kaizan-oplossing, waarbij het gewenste gebied voor depositie volledig wordt ondergedompeld.

Pas gedurende twee minuten een constante stroom toe, berekend op een dichtheid van vier ampère per vierkante meter op basis van het oppervlak van de werkelektrode. In dit geval wordt een stroom van 16 µA aangelegd op een gouden elektrode van vier mm², waarbij de spanning zal verschuiven binnen het bereik van twee tot drie volt. Spoel vervolgens de elektrode met gedeïoniseerd water om overtollig chitosan te verwijderen. Ga over tot het afbeelden van de film met een fluorescentiemicroscoop; copos chitosan en glucose-oxidase zijn vanuit een oplossing bij een stroomdichtheid van vier ampère per vierkante meter op een gepatroneerde elektrode aangebracht.

Volgens de procedure voor de depositie van de chitosan-elektrode wordt een kaizan-film gegenereerd waarin glucose-oxidase is ingesloten. Bevestig de behandelde elektrode als werkelektrode aan een drieelektrodensysteem, met een platina draad als tegenelektrode en zilver/zilverchloride als referentie-elektrode; dompel de elektroden onder in een fosfaatbuffersolution die natriumchloride bevat. Conjugeer het eiwit elektrochemisch aan de Kazam-film door middel van chronopyrometrie door gedurende 60 seconden een constante spanning aan te leggen na de conjugatie.

Plaats de chip in fosfaatbuffer en was deze 10 minuten op een orbitale schudder om onreactief natriumchloride en niet-geconjugeerd glucose-oxidase te verwijderen. Sluit het drieelektrodensysteem opnieuw aan en dompel dit onder in een oplossing van 5 millimolaire glucose. Stel vervolgens de gewenste parameters voor cyclische voltammetrie in om het potentieel in positieve richting tot 0,7 volt te scannen.

Verwijder de elektroden uit de glucose-oplossing en spoel deze af met fosfaatbuffer. Plaats de elektroden vervolgens in een bekerglas van 10 milliliter met acht milliliter fosfaatbuffer op een magnetische roerplaat. Stel de GOX-gefunctionaliseerde chip in op 0,6 volt om als werkelektrode te dienen.

Nadat de gewenste parameters zijn ingesteld, wordt een basislijnmeting verzameld. Voeg aliquoten glucose toe aan de buffer om de glucoseconcentratie met vier millimolair per aliquot te verhogen. In dit experiment worden aliquoten van 400 µL 80 millimolair glucose aan de buffer toegevoegd. Correleer de gemeten stroom aan elke glucoseconcentratie. Om een standaardcurve te genereren voor de functionalisering van eiwitten, wordt een glazen objectglas gebruikt met een patroon van naast elkaar gelegen goud- en ITO-elektroden, ingesloten in A-P-D-M-S.

Zet de gouden elektrode onder een kathodisch potentiaal om tizen elektrochemisch neer te slaan, zoals eerder beschreven. Spoel de film na en voeg een oplossing toe van blauw fluorescent gelabelde auto-inducer-2-synthase aangevuld met tyrosinase. Laat dit vervolgens één uur incuberen bij kamertemperatuur.

Spoel de film zoals eerder beschreven met PBS, breng een anodisch potentieel aan op de ITO-elektrode die is ondergedompeld in een alginaatdepositie-oplossing met ontvangercellen. Ga verder met dezelfde stappen als beschreven bij de co-depositie van celpopulaties in alginaat om het verzonden signaal enzymatisch te genereren. Voeg na het spoelen van de films een oplossing toe van vijf micromolair SAH en PBS, aangevuld met 10% LB-medium en één millimolair.

Dek de elektroden af met calciumchloride om verdamping van de oplossing te voorkomen en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Dit maakt een respons van de ontvangercel mogelijk door de generering van een rood fluorescent eiwit DS red; aangrenzende elektroden kunnen worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie door de filters zo in te stellen dat zowel de blauwe fluorescentie van de inducer two synthase als de rode fluorescentie die wordt tot expressie gebracht door de gecoöpteerde ontvangercellen worden vastgelegd. Opgedrukte elektrische signalen kunnen gelokaliseerde micro-omgevingen nabij een elektrode-oppervlak creëren, en deze stimuli kunnen de zelfassemblage van polysachariden zoals alginaat en razan triggeren om als een hydrogel-film op het elektrode-oppervlak te neerslaan.

Omdat deze sol-gelovergang plaatsvindt aan het elektrode-oppervlak, is de resulterende film elektro-geadresseerd met een geometrie die overeenkomt met het elektrodepatroon. Met behulp van alginaat zijn unieke celpopulaties co-gedeponeerd op afzonderlijke adressen. Bewijs van hun elektrode-adressering wordt waargenomen bij interactie tussen de zender- en ontvanger-celpopulatie.

Het molecuul auto-inducer twee diffundeert vanuit de zendercellen en wordt opgenomen door de ontvangercellen, wat leidt tot expressie van het DS red-fluorescent eiwit. Hierbij wordt rode fluorescentie alleen waargenomen bij de elektrode waar de ontvangers worden geadresseerd. Omgekeerd biedt het biosensor-enzym glucose-oxidase de mogelijkheid om glucose te detecteren via een enzymatische reactie door waterstofperoxide te produceren, dat vervolgens elektrochemisch kan worden geoxideerd om een uitgangsstroom te genereren.

Op deze manier kan een chemisch signaal worden omgezet in een elektrisch signaal. Deze grafiek laat zien dat films waarin Geo X chemisch was geconjugeerd een sterk antisignaal produceren in de aanwezigheid van glucose, in tegenstelling tot films zonder Geo X. Deze resultaten geven aan dat Geo X op een gedeponeerde zam-film kan worden samengesteld en/of katalytische activiteit behoudt. Bovendien wordt een stapsgewijze toename van een otische stroom geproduceerd als reactie op toenemende glucoseconcentraties.

De getoonde standaardcurve laat zien dat de stapsgewijze toenames in een bijna lineaire mate plaatsvonden, afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegde glucose. Deze resultaten tonen aan dat het enzym ook zijn gevoeligheid behoudt na conjugatie aan de Razza-film; zoals hier afgebeeld, bevat de I two synthase een Penta tyrosine-tag. Tyrosinase werkt in op de tyrosine-tag door de fenolgroepen van de residuen te oxideren tot o-chinonen, die vervolgens covalent binden aan de aminegroepen van de Kazam-film. Bewijs van functionalisering van de Kazam-film binnen de a i two synthase door tyrosinase-assemblage is te zien in deze fluorescentieafbeelding, waarop een kaza-film op goud wordt getoond waarbij de gefunctionaliseerde I two synthase blauw fluorescent gelabeld is. Omdat een I two synthase een I two genereert uit het substraat SAH op dezelfde wijze als de zendercellen, zorgt de nabijheid van gecoöpteerde ontvangercellen in aanwezigheid van SAH er ook voor dat de ontvangercellen fluorescent reageren door ds te expresseren.

De rode fluorescentie van de ontvangercellen demonstreert opnieuw de interactie tussen adressen door de diffusie van ai, twee van de ene naar de andere, en geeft verder aan dat 10 enzymen geïmmobiliseerd aan tizen hun activiteit behouden zodra ze covalent gebonden zijn. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u polysacharidefilms elektrodepositeert en hoe u deze functionaliseert met behulp van diverse technieken. We hebben de veelzijdigheid van deze functionalisatiestappen aangetoond, waardoor we in verdere tests met een multitude aan biologische componenten kunnen werken.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in slechts enkele minuten worden uitgevoerd om goed gedefinieerde filmpatronen te genereren waarop biologische componenten nauwkeurig kunnen worden geënt. Op deze manier kunnen we zeer eenvoudig biologisch gepatronde en actieve oppervlakken op aangewezen elektroden creëren, waarbij alles op een georganiseerde wijze gebeurt en toch complexe biologische interacties kunnen worden gerealiseerd. Na deze procedure kan creativiteit worden toegepast, zowel bij het ontwerp van de elektrode-array als bij de keuze van de biologische componenten, om de beoogde interactie te bereiken.

Onze hoop is dat de biofabricatietools twee uiteenlopende vakgebieden zullen overbruggen, biotechnologie en micro-elektronica, die elk afzonderlijk ons leven hebben gerevolutioneerd. Door deze twee velden te koppelen, geloven we dat we nieuwe oplossingen zullen creëren voor enkele van de meest urgente problemen van de samenleving. Zo voorzien we bijvoorbeeld dat biofabricatie eenvoudige en veelzijdige methoden kan bieden voor nieuwe manieren van detectie, voor point-of-care, de diagnose van ziekten en het detecteren van biologische en chemische dreigingen.

Een voorbeeld van een verregaande toepassing zou kunnen zijn dat de volgende generatie arteriële stents niet alleen in staat is om de slagader open te houden, maar ook om uw metabole profiel te bewaken.