Compact Quantum Dots voor Single-molecule Imaging

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van fluorescerende quantum dots met een geoptimaliseerde helderheid en stabiliteit, evenals een minimale grootte en minimale aspecifieke binding voor gebruik in single molecule imaging. Dit wordt bereikt door eerst kleine cadmiumselenide quantum dot-kernen te prepareren. De tweede stap is om deze kernen te legeren met kwik om hun fluorescentie te verschuiven naar het rode spectrum en hun helderheid te verhogen.

Vervolgens wordt een dunne legeringsschil op de nanokristallen gegroeid om hun fluorescentie-emissie te stabiliseren. De laatste stap is het overbrengen van deze deeltjes van organische oplosmiddelen naar waterige buffers met behulp van een multidentaat polymeer, dat kan worden gemodificeerd met biologisch inerte polyethyleenglycol. Ten slotte worden fluorescentiespectrometrie, gelchromatografie en gelelektroforese gebruikt om aan te tonen dat deze deeltjes een heldere fluorescentie, een compacte hydrodynamische grootte en een neutrale elektrostatische lading hebben, eigenschappen die zeer geschikt zijn voor single-molecule fluorescentie-imaging in de biologie.

Het belangrijkste voordeel van deze quantum dots ten opzichte van bestaande commerciële materialen is dat deze nanodeeltjes een aanzienlijk kleinere hydrodynamische grootte hebben. Hoewel kleinere quantum dots negatief worden beïnvloed door een afgenomen fluorescentie-intensiteit, een verminderde fluorescentiestabiliteit en fluorescentie die beperkt is tot het blauwe spectrum, hebben we deze effecten gecompenseerd middels een kwik-kationuitwisselingsproces. Deze nanokristallen kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biofysica en cellulaire signalering door dynamische beeldvorming van enkele biomoleculen in drukke biologische omgevingen mogelijk te maken.

Bereid eerst een 0,4 molaire oplossing van selenium in top door selenium toe te voegen aan een driehalskolf van 50 milliliter, de kolf te evacueren onder hoog vacuüm en deze te vullen met argon met behulp van een sch shank-lijn onder luchtvrije omstandigheden. Voeg 10 milliliter top toe en verhit dit onder roeren gedurende één uur tot 100 °C om een heldere, kleurloze oplossing te verkrijgen.

Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en zet de kolf opzij. Bereid daarnaast een oplossing van cadmiumoxide TDPA en ODE voor in een driehalskolf van 250 milliliter met de hoeveelheden die in het schriftelijke protocol staan vermeld. Vacumeer de oplossing onder roering met behulp van een vacuümlijn, zoals getoond in deze video.

Verhoog de temperatuur naar 100 °C en vacumeer gedurende nog eens 15 minuten. Om onzuiverheden met een laag kookpunt onder argon gas te verwijderen, wordt het mengsel één uur verhit tot 300 °C om het cadmiumoxide volledig op te lossen. De oplossing zal van kleur veranderen van roodachtig naar helder en kleurloos; koel de oplossing vervolgens af tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens HDA toe aan de cadmiumoplossing, verhit deze tot 70 °C en vacumeer het systeem. Zodra een constante druk is bereikt, wordt de temperatuur verhoogd en de oplossing gedurende 30 minuten teruggevloeid. Zet de klep van de Schlenk-lijn om naar inert gas en plaats het thermokoppel direct in de oplossing.

Voeg onder zuurstofvrije omstandigheden DPP toe aan de cadmiumoplossing en verhoog de temperatuur tot 310 °C. Gebruik nu een wegwerpspuit met een naald van 16 gauge om 7,5 mL van de 0,4 M bovenste seleniumoplossing af te nemen. Zodra de temperatuur is gestabiliseerd op 310 °C, stelt u de temperatuurregelaar in op 0 °C en injecteert u de bovenste seleniumoplossing snel rechtstreeks in de cadmiumoplossing.

De oplossing zal veranderen van kleurloos naar geel en oranje, waarbij de temperatuur snel zal dalen en vervolgens weer zal stijgen tot ongeveer 280 degrees Celsius. De moeilijkste stap in deze procedure is om het volledige volume van de spuit zo snel mogelijk in de cadmiumoplossing te injecteren. Dit zorgt ervoor dat de deeltjes homogeen nucleëren.

Verwijder de kolf na één minuut reactie uit de verwarmingsmantel en koel deze snel af met een luchtstroom totdat de temperatuur lager is dan 200 °C. Wanneer de temperatuur ongeveer 40 °C bereikt, wordt het mengsel verdund met 30 mL hexaan, waardoor het grootste deel van de resterende cadmiumprecursor uit de oplossing zal neerslaan. Verwijder dit precipitaat door middel van centrifugatie.

Verdun in elk van zes polypropyleen conische centrifugebuizen van 50 milliliter 12 milliliter van de resulterende ruwe nano Krystal-oplossing. Voeg 40 milliliter aceton toe en schenk na centrifugatie met dezelfde parameters het supernatant voorzichtig af en gooi dit weg. Los vervolgens de nano krysttal-pellets op in hexaan.

Extraheer de oplossing met een gelijk volume methanol en behoud de bovenste fase. Herhaal deze extractie nog twee keer voor de derde extractie. Het volume methanol kan worden aangepast naar ongeveer 15 milliliters om een geconcentreerde hexaanoplossing van zuivere cadmiumselenide quantum dots van ongeveer 200 micromolar te verkrijgen.

De typische opbrengst van deze reactie bestaat uit cadmiumselenidekristallen van drie micromolair met een diameter van twee tot drie nanometer. Bepaal de diameter en concentratie van de nanokristallen door het ultraviolet-zichtbare absorptiespectrum te meten zoals beschreven in de schriftelijke procedure. De nanokristallen kunnen gedeeltelijk worden uitgewisseld met kwik om de absorptie en fluorescentie-emissie naar rood te verschuiven. Meng hiervoor hexaan en chloroform in een glazen flesje van 20 milliliter met een roerstaaf en voeg vervolgens de cadmiumselenide quantum dot-oplossing, OLA en kwikoctanoaat toe. Nadat de nanokristallen zijn gezuiverd en hun concentratie is bepaald zoals beschreven in de schriftelijke procedure, moeten de nanokristallen ten minste 24 uur bij kamertemperatuur rijpen voor de groei van de schil.

Bereid 0,1 molaire precursor-oplossingen voor de schil in driehalskolven van 50 milliliter; verhit onder vacuüm de oplossingen van de cadmium-precursor, zink-precursor en zwavel-precursor tot reflux gedurende één uur om heldere oplossingen te verkrijgen, en vul vervolgens een driehalskolf met argon. Voeg de topo ODE en de bereide kwantumstippen van cadmiumselenide-kwik toe. Verwijder het hexaan bij kamertemperatuur via de vacuümlijn.

Verhoog de temperatuur tot 100 °C en refluxeer gedurende 15 minuten. Zet het lijnventiel naar argon gas en plaats het thermokoppel in de nano Krystal-oplossing. Nadat de temperatuur is verhoogd tot 120 °C, voegt u 0,5 monolagen of 140 µL van de zwavelprecursor-oplossing toe en laat u de reactie 15 minuten lopen.

Verhoog de temperatuur naar 140 °C. Voeg 0,5 monolagen of 140 µL cadmiumprecursoroplossing toe en laat de reactie 15 minuten lopen. Voeg vervolgens 500 µL watervrije OLA toe aan de reactieoplossing.

Verwarm tot 160 °C, voeg 0,5 monolagen of 220 µL zwavelprecursoroplossing toe, gevolgd door een gelijke hoeveelheid zinkprecursoroplossing bij 170 °C, met een tussenpoos van 15 minuten tussen elke toevoeging. Voeg vervolgens bij 180 °C 0,25 monolagen of 150 µL zwavelprecursoroplossing en zinkprecursoroplossing toe in intervallen van 15 minuten. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en bepaal een nieuwe extinctiecoëfficiënt voor deze deeltjes.

Bewaar de reactie-oplossing als ruw mengsel in een vriezer, uitgaande van een UV-vis spectrum waarbij wordt aangenomen dat het aantal nanokristallen niet is veranderd. In dit stadium kunnen de nanokristallen worden gekarakteriseerd met behulp van elektronenmicroscopie, UV-vis absorptiespectroscopie en fluorescentiespectroscopie. Voeg gezuiverde core-shell quantum dots toe aan een driehalskolf van 50 milliliter en verwijder het hexaan onder hoog vacuüm.

Om een droge film te verkrijgen, wordt de kolf gevuld met argon. Voeg watervrije purine toe aan de nanodeeltjesfilm en verhit de slurry gedurende één tot twee uur tot 80 °C. De nanodeeltjes zullen volledig oplossen.

Voeg één milliliter van één FIO glycerol toe aan de oplossing en roer twee uur lang bij 80 °C. Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt 0,5 milliliter triethylamine toegevoegd om de thioglycerol te deprotoneren, waarna het mengsel 30 minuten wordt geroerd. De oplossing kan na toevoeging van triethylamine troebel worden door de geringe oplosbaarheid van polaire nanokristallen in dit oplosmiddelmengsel.

Overbreng de quantum dot-oplossing naar een conische centrifugebuis van 50 milliliter die een mengsel van 20 milliliter hexaan en 20 milliliter aceton bevat en meng goed. Isoleer de neergeslagen nanokristallen via centrifugatie, gevolgd door het wassen van het pellet met aceton, los het quantum dot-pellet op in vijf milliliter DMSO met behulp van een badsonicator en centrifugeer vervolgens opnieuw. Verwijder eventuele aggregaten en bepaal daarna de nanodeeltjesconcentratie aan de hand van een UV-Vis absorptiespectrum.

De oplossing van pure quantum dots dient binnen drie uur te worden gebruikt, aangezien het oppervlak onder omgevingsomstandigheden in de lucht langzaam kan oxideren. Verdun de quantum dot-oplossing met DMSO tot 10 µM of minder en breng deze over naar een kolf van 50 mL. Voeg een bereide oplossing van 5 mg/mL gedilueerd polyacrylzuur in DMSO druppelsgewijs toe aan de quantum dot-oplossing onder roering en ontgas de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Spoel de quantumdot-polymeeroplossing door met argon en verhit deze 90 minuten lang tot 80 °C. Nadat de oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt er druppelsgewijs een gelijk volume 50 millimolair natrium bij pH 8 toegevoegd, waarna het mengsel 10 minuten wordt geroerd. Zuiver de quantumdots zoals beschreven in de geschreven procedure en bepaal de concentratie aan de hand van een UV-vis-absorptiespectrum. Meng in een glazen vial van 4 ml met roerstaaf één mol quantumdots in boraatbuffer met een 40.000-voudig moloverschot aan 750 Dalton mono-amino polyethyleenglycol.

Instructies voor het toevoegen van specifieke chemische functionaliteit aan de nanokristallen zijn te vinden in de schriftelijke procedure. Voeg snel een 25.000 keer molaire overmaat van een vers bereide oplossing van het activeringsmiddel toe aan de quantum dot-oplossing en roer dit gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap nog vier keer om het oppervlak van het nanokristal met PEG te verzadigen.

Voeg ten slotte 200 µL van een 1 M trisbuffer toe om de reactie te stoppen voordat de nanokristallen worden gezuiverd met behulp van dialysecentrifugatiefilters of ultracentrifugatie. De resulterende nanokristallen kunnen worden geanalyseerd op monodispersiteit, hydrodynamische grootte en oppervlaktelading met behulp van vloeistofchromatografie, gelelektroforese en fluorescentiemicroscopie. Hier worden representatieve absorptie- en fluorescentiespectra getoond voor cadmiumselenidenanokristallen, kwik-cadmiumselenidenanokristallen na kationuitwisseling, en kern-kwikcadmiumselenide, schil-cadmiumzinksulfidenanokristallen na schilgroeing. De kern-cadmiumselenidenanokristallen hebben een fluorescentiequantumopbrengst van circa 15%. Deze efficiëntie daalt echter naar minder dan 1% na kwikuitwisseling, waarschijnlijk door ladingdrager-traps die zijn geïntroduceerd door verstoring van de oppervlakteatomen.

De groei van een dunne schil van cadmiumzinksulfide verhoogt deze efficiëntie tot meer dan 70%, wat grotendeels behouden blijft na overdracht naar water. In tegenstelling hiermee verliezen nanokristallen met een kern van cadmiumselenide en een schil van cadmiumzinksulfide zonder kwikincorporatie een aanzienlijk deel van hun quantumopbrengst in water, tenzij er een dikke schil wordt gekweekt. Het is belangrijk op te merken dat capping met cadmiumzinksulfide de spectra naar het rood verschuift door lekkage van de elektronische ladingsdragers in het schilmateriaal.

Deze verschuiving bedraagt ongeveer 20 tot 30 nanometer voor cadmiumkernen en neemt toe naarmate het kwikgehalte in de kern stijgt. Door kwik in het nanokristalkern in te bouwen, kan de kleine omvang van het nanokristal dus behouden blijven zonder in te leveren op helderheid. De kleine omvang wordt aangetoond in deze transmissie-elektronenmicrografie en deeltjesgrootteverdeling van cadmium-kwik-selenide kern/cadmium-zinksulfide schil nanokristallen, die een gemiddelde diameter van 3,2 plus of min 0,6 nanometer vertonen.

Het gebruik van een tweestaps faseoverdracht naar water is essentieel voor het verkrijgen van een homogene populatie nanokristallen die geen verdere grootte-sortering vereisen om clusters en aggregaten te verwijderen. Het hier afgebeelde grootte-uitsluitingschromatogram bevestigt dat de grootte vergelijkbaar is met die van conalbumine. Bij 75 kilodalton en na modificatie met 750 Dalton amino-PEG is de grootte toegenomen tot slechts 12 nanometer, vergelijkbaar met die van een IgG-antilichaam.

PEG-modificatie neutraliseert de oppervlaktelading, zoals bevestigd in het hier afgebeelde agarosegel-elektroforese-experiment; de put is gemarkeerd met een pijl en de elektrodepolariteiten zijn rechts aangegeven, waaruit blijkt dat de nanokristallen vóór conjugatie als ionische deeltjes migreren en dat de gepegyleerde nanokristallen elektrostatisch neutraal zijn. Hier wordt een epifluorescentie-micrografie getoond van deze nanokristallen, gedeponeerd op een glazen dekglas en geëxciteerd met zichtbaar licht van 545 nanometer. Deze nanokristallen zijn gemakkelijk waarneembaar op single-molecule niveau bij 30 frames per seconde met een elektron-multiplicerende CCD-camera.

Deze grafiek laat zien dat het aantal fluorescerende deeltjes dat in elk frame wordt waargenomen, in de loop van de tijd fluctueert bij continue excitatie. Dit is het gevolg van een combinatie van blinking en fotodegradatie. Blinking is dominant gedurende de eerste zeven minuten, waarna oxidatieve fotodegradatie langzaam zichtbaar wordt.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u quantum dots chemisch kunt synthetiseren, hoe u deze kunt overbrengen naar waterige buffers en hoe u ze kunt modificeren voor bio-imagingtoepassingen. Vergeet niet dat het werken met reagentia die cadmium en kwik bevatten extreem gevaarlijk kan zijn en dat er extra voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om persoonlijke blootstelling te voorkomen.