Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Het algemene doel van de beschreven experimenten is het optisch monitoren van de integratie van membraanpotentiaalsignalen en informatieverwerking door een individuele zenuwcel met submicrometer- en submilliseconde-resolutie vanaf meerdere locaties op een neuron. Dit wordt bereikt door eerst een imaging-opstelling te bouwen met een geschikte gevoeligheid om de registratie van kleine fractionele veranderingen in lichtintensiteit mogelijk te maken die overeenkomen met de transiënten van het membraanpotentiaal. Vervolgens worden neuronen geselecteerd met een geschikte anatomie voor effectieve imaging, namelijk neuronen met lange, intacte uitlopers in één enkel brandvlak dicht bij het oppervlak van het snede preparaat.

Laad vervolgens de vooraf geselecteerde neuronen met voltagesensitieve kleurstoffen om optische tracking van de veranderingen in het membraanpotentiaal mogelijk te maken. De resultaten tonen de unieke mogelijkheid van deze benadering om informatie te verkrijgen over de integratie van elektrische signalen door individuele zenuwcellen door het monitoren van membraanpotentiaalsignalen van axonen, dendrieten en dendritische stekels. In de cellulaire neurofysiologie.

Nieuwe instrumenten worden ontwikkeld vanwege de twee langdurige beperkingen van conventionele elektrofysiologie: de lage ruimtelijke resolutie van elektrode-metingen en het onvermogen om opnames te maken van kleine structuren zoals axoncollateralen of dendritische stekels. Om deze nadelen te overwinnen, kan de patch-elektrodebenadering worden gecombineerd met optische technieken die parallelle opnames mogelijk maken van alle delen van een neuron. Hier beschrijven we een dergelijke techniek: meerdere zijdelingse optische registratie van membraanpotentiaaltransiënten met resolutie op enkele stekels.

In dit experiment worden een rechtopstaande microscoop en drie camera's gebruikt om een uniforme verlichting af te stellen. Plaats eerst een geschikt neutraal dichtheidsfilter in het pad van de laserstraal. Focus vervolgens het objectief op het oppervlak van de standaard fluorescentieglaasje.

Pas, terwijl het CCD-beeld van het gezichtsveld op het monitorscherm wordt geobserveerd, de positie van het ontvangende uiteinde van de kwartslichtgeleider en de positie van het uitgaande uiteinde van de lichtgeleider aan met behulp van de geschikte actuatoren op de epifluorescentiecondensor, om een gecentreerde en uniforme verlichting van het gezichtsveld te bereiken. Gebruik om de vibratieruis te bepalen een standaard fluorescentiepreparaat met een niet-fluorescerende markering op het oppervlak. Registreer de lichtintensiteit met de neuro CCD in de continue modus.

Richt het objectief op een donkere rand van de zwarte markering en registreer de lichtintensiteit gedurende ongeveer 100 milliseconden bij een framerate van twee kilohertz. Toon vervolgens het ruimtelijk gemiddelde van de fractionele lichtintensiteitssporen van ongeveer 20 pixels die licht ontvangen uit het uniform verlichte gebied en van ongeveer 20 pixels langs de rand van de zwarte markering. De overtollige ruis in het ruimtelijk gemiddelde van de pixels met contrastrijke randen weerspiegelt de vibrationele ruis in het systeem.

Het is essentieel om de mechanische sluiter buiten de trillingsisolatietafel te monteren, zodat het openen van de sluiter geen trillingsruis introduceert in de optische registratie. Dit is een kritische stap. Monteer de sluiter met plastic schroeven en trillingsisolerend materiaal om de akoestische trillingsruis te verminderen die door het optische registratiesysteem kan worden opgepikt.

Om trillingen te isoleren, stelt u de trillingsisolatietafel in totdat de trillingsruis van de pixels die de scherpe rand van het beeld beslaan, kleiner is dan de shotruis. De bedrading van de apparatuur op de tafel moet losjes liggen om te voorkomen dat mechanische trillingen worden overgedragen op de microscoop. Bereid bij deze procedure hersensecties met een dikte van 300 tot 400 micron voor volgens standaardprocedures met een muizenlijn die EGFP tot expressie brengt in de betreffende individuele zenuwcellen met een spinning disc confocale microscoop.

Visualiseer de EGFP-gelabelde neuronen in de slice. Selecteer vervolgens de neuronen met intacte dendritische axonale bomen en met uitlopers die parallel en dicht bij het oppervlak van de slice lopen voor membraanpotentiaal-imaging. Vul daarna een glazen patchpipet vanaf de punt met kleurstofvrije intracellulaire oplossing tot twee derde van de taper van de elektrode door gedurende ongeveer 15 seconden negatieve druk toe te passen.

Vul daarna de elektrode aan met de oplossing die de membraan IMP permeaat spanningsgevoelige kleurstof bevat, opgelost in de intracellulaire oplossing. Patch nu een eerder geselecteerd neuron binnen één minuut nadat de kleurstof in de elektrode is geladen. Breng een lage positieve druk van ongeveer 10 millimeter kwik aan voordat de pipet in het bad wordt gelaten; tijdens het positioneren van de elektrode in de slice zorgt dit ervoor dat er geen kleurstof uit de elektrode lekt voordat de seal is gevormd.

Verhoog de druk naar een hoge waarde van ongeveer 100 millimeter kwik vlak voordat de elektrode het celoppervlak raakt. Zodra de zegel in de whole-cell configuratie is vastgesteld, laat u de kleurstof gedurende 20 tot 45 minuten vrij diffunderen vanuit een somatische patchpipet naar het soma. Tijdens deze diffusie van de kleurstof monitort u de fysiologische toestand van het neuron door de opgewekte actiepotentialen in de current-clamp modus te registreren.

Beweek daarnaast de hoeveelheid kleuring door de rustlichtintensiteit van het cellichaam te registreren met een framerate van twee kilohertz en een fractie van de volledige lichtintensiteit, ingesteld met neutrale dichtheidsfilters. Zet het downloadproces voort tot het actiepotentiaal begint te verbreden. Trek aan het einde van de kleuring de patchpipet voorzichtig weg van het soma in spanningsclampconfiguratie om ervoor te zorgen dat de overgang van whole-cell naar outside-out patchconfiguratie tijdens dit proces wordt bereikt.

Incubeer de slice vervolgens nog 1,5 tot twee uur bij kamertemperatuur om de voltagesensitieve kleurstof te laten verspreiden in de neuronale uitlopers. Nadat een aanzienlijke hoeveelheid kleurstof vanuit het soma in de dendritische en axonale uitlopers is gediffundeerd, zou de golfvorm van de actiepotentiaal volledig hersteld moeten zijn. Lokaliseer in de volgende stap het soma van het gekleurde neuron onder lage intensiteit fluorescentie.

Verminder de lichtintensiteit met neutrale densiteitsfilters tot het minimum dat nodig is om het object van belang te visualiseren met behulp van een XY-tafel. Scan het gebied van de plak die het fluorescente neuron bevat totdat het fluorescente soma is geïdentificeerd. Positioneer het soma van de gekleurde cel in het centrum van het microscopieveld en patch het neuron met een standaard patchelektrode zonder kleurstof onder DIC. Visualiseer vervolgens de neuronale processen onder fluorescentie met lage intensiteit bij een framerate van 10 tot 40 hertz in de continue opnamemodus van de CCD voor spanningsimaging.

Positioneer met behulp van de XY-tafel het neuronale uitsteeksel van belang in het midden van het beeldveld. Bescherm daarnaast de SOMA tegen het excitatielicht door gebruik te maken van de gedeeltelijk gesloten diafragmaschijf van de microscoop om fotodynamische schade te verminderen. Registreer vervolgens de optische signalen die gerelateerd zijn aan terugpropagerende actiepotentialen in de individuele dendritische takken.

Registreer vervolgens de optische signalen die gerelateerd zijn aan actiepotentialen in het axon. Registreer daarna de optische signalen die gerelateerd zijn aan terugpropagerende actiepotentialen in de dendritische stekels. Gebruik de juiste framerate voor een nauwkeurige reconstructie van de golfvorm van het signaal.

Houd tegelijkertijd de opnameperioden en de blootstelling aan excitatielicht met een hoge intensiteit zo kort mogelijk, om dye-bleaching en fotodynamische schade te minimaliseren. De opname van optische signalen wordt hier getoond. Het bovenste paneel toont de confocale afbeelding met hoge resolutie van een gekleurd neuron met zijn axon in de opnamepositie.

Terwijl het middelste paneel het fluorescentiebeeld van het axon met een lage ruimtelijke resolutie toont, verkregen met de CCD die werd gebruikt voor membraanpotentiaal-imaging, presenteert het onderste paneel de elektrode-registraties van het soma en de optische registraties van de A IS en de node of rvi. De ruwe gegevens en de verwerkte signalen worden getoond. Deze figuur toont de actiepotentiaalsignalen van het axon van een L vijf corticaal neuron dat is geladen met de spanningsgevoelige kleurstof action.

Potentiële gerelateerde signalen werden geregistreerd met een framerate van 10 kilohertz. Deze sporen geven de actiepotentiaaltransiënt weer vanuit drie locaties. Ten eerste de elektrode die vanuit het soma registreert.

Twee, de optische opnames van de axonheuvel, en drie, de optische opname van de eerste knoop van vie, en hier zijn de gesuperponeerde signalen van dezelfde drie locaties. Deze figuur toont een burst van vier terugpropagerende actiepotentiaalsignalen vanuit meerdere locaties op het dendritische arbor van een L5 corticaal neuron, geïnitieerd door korte depolariserende stroompulsen bij 100 hertz. Hier worden de actiepotentiaalsignalen van een individuele dendritische spine getoond.

Hier is de anatomische reconstructie verkregen uit een stapel spinning-disc confocale beelden, en hier is het fluorescentiebeeld van hetzelfde gebied verkregen met de CCD-camera. Voor membraanpotentiaal-imaging worden in het rechterpaneel de fluorescentie-intensiteitssporen getoond die overeenkomen met terugpropagerende actiepotentialen van locaties één tot en met drie, zoals aangegeven op het CCD-beeld. Het onderste spoor geeft de elektrodeopname van het soma aan.

De voorbereiding voorafgaand aan de registratie duurt ongeveer drie uur, inclusief de wachttijd totdat de dendrieten zich uitbreiden naar de distale processen. De registratietijd wordt beperkt door de normale degradatie van het preparaat en door fotodynamische schade door PO. De mate van fotodynamische schade is proportioneel aan de intensiteit van het excitatielicht, en aan de duur en het aantal individuele registratie-experimenten.

In sommige experimenten is het mogelijk om meer dan 50 opnamemetingen uit te voeren over één of twee uur. Andere metingen vereisen een hoge excitatie, lichtintensiteiten en langere opnames, en zijn beperkt tot slechts enkele opnamemetingen vanwege fotodynamische schade. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u spanningsimaging kunt uitvoeren van de gehele axonale en dendritische structuur van individuele neuronen in hersensnijden.