Onderzoek van thymus positieve en negatieve selectie via flowcytometrie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling van de thymus bij muizen te onderzoeken middels flowcytometrie. Dit wordt bereikt door enkelcellussies voor te bereiden uit de thymus en milt van de muis. Als tweede stap worden de thymocyten en splenocyten gekleurd met een cocktail van antilichamen voor de identificatie van specifieke thymuspopulaties.

Uiteindelijk kunnen de frequentie en het aantal van diverse lymfocytenpopulaties worden geëvalueerd via flowcytometrische analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de T-celontwikkeling, zoals welke genen en signaalpaden belangrijk zijn voor het genereren van een functioneel maar celtolerant T-celrepertoire. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de T-celontwikkeling in de thymus, kan ze ook worden toegepast bij het onderzoek naar de ontwikkeling van andere immuuncellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het ontwerp van hun antilichaamcocktails voor flowcytometrie. Plaats voor aanvang van de dissectie een steriel stalen gaaszeefje in een Petrischaal van 60 bij 15 millimeter. Voeg vervolgens vijf milliliters HBSS aan de schaal toe en bewaar de schaal op ijs om de thymus te oogsten.

Gebruik eerst een pincet om de onderste punt van het borstbeen op te tillen en het diafragma bloot te leggen. Snijd vervolgens het diafragma door, waarbij de lever wordt ontzien, om de borstkas los te maken en snijd daarna de borstkas aan beide zijden in opwaartse richting door. Zorg er hierbij voor dat de longen en het hart niet worden geraakt.

Gebruik nu de pincet om de ribbenkast voorzichtig terug te trekken. De thymus is een wit, tweelobbig orgaan dat zich boven het hart bevindt. Gebruik de platte zijde van de pincet om de onderkant van de lobben vast te pakken.

Trek vervolgens voorzichtig de thymus eruit en plaats deze op een van de eerder geprepareerde gaasschermen. Om de milt te oogsten, wordt een incisie door het peritoneum gemaakt om de buikholte bloot te leggen. De milt is een rood, surfboardvormig orgaan dat zich aan de linkerzijde van de buikholte van de muis bevindt, onder de lever.

Gebruik vervolgens één pincet om de milt te verwijderen en een andere om het bindweefsel weg te scheiden. Plaats de gedissecteerde milt vervolgens op een apart gaaszeefje. Gebruik nu de zuiger van een spuit van 3 mL om elk orgaan door het gaaszeefje te malen totdat er alleen bindweefsel en vet overblijven; pipetteer de cellen en HBSS in een conische buis van 15 mL.

Spoel vervolgens elk gaas 3 keer met verse HBS. Pelleteer daarna de cellen gedurende vijf minuten bij 335 ×g en vier graden Celsius. Na het aspireren van het supernatant worden de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gesuspendeerd in 500 µL CK lysisbuffer, terwijl de milt-erytrocyten worden gelyseerd.

Suspendeer de thymocyten in FACS-buffer op een concentratie van 20 × 10⁶ cellen per milliliter en zet ze op ijs. Voeg nu vijf milliliter HBSS toe om de isotoniciteit van de cellen te herstellen nadat de cellen opnieuw zijn gecentrifugeerd; resuspendeer het pellet zonder erytrocyten op 20 × 10⁶ cellen per milliliter in FACS-buffer. Begin deze stap door aliquoten te maken.

Voeg 4 × 10⁶ van de gereserveerde THYMOCYTES per flowcytometrie-monster toe aan elke put van een 96-wellplaat. Voeg vervolgens cytes toe aan de putten van een 96-wellplaat voor compensatiecontroles. Blok daarna de FC-receptoren in elk van de celmonsters door incubatie met anti CD 1632 gedurende 10 minuten op ijs.

Centrifuge de plaat nu kort en verwijder vervolgens de vloeistof uit de wells door de plaat eenmaal ondersteboven tegen een gootsteen aan te tikken. Resuspendeer elke well vervolgens in 200 µL fax-buffer en herhaal de wasstap. Incubeer daarna de experimentele monsters met 200 µL antilichaamcocktail of enkelvoudige fluorochroom-geconjugeerde antilichamen voor de compensatiecontroles. Dit alles in fax-buffer, op ijs en in het donker.

Was na 30 minuten de cellen twee keer met fax-buffer en breng de monsters, na resuspensie van de cellen in fax-buffer, over naar fax-buisjes in fysiologische TCR-transgene modellen en wild-type muizen. Positieve selectie begint in het double positive bright-stadium voordat men overgaat naar het double positive dull-stadium. Na ontmoeting met het antigeen gaan de double positive dull-thymocyten een transitioneel CD4-positief CD8-laag stadium in voordat ze CD4 worden.

Single-positieve of CD8 single-positieve thymocyten: rijpe single-positieve thymocyten worden gekenmerkt door hun hoge TCR-expressie en het verlies van CD24. Hoewel het CD8- versus CD4-profiel defecten in de positieve selectie kan onthullen, kan het onderzoeken van TCR beta versus CD69 of CD5 verder inzicht bieden in waar het defect zich bevindt. Zowel CD69 als CD5 worden opgereguleerd na TCR-stimulatie, waarbij sterkere interacties leiden tot een hogere expressie van deze markers.

In deze TCR beta versus CD 69 plot van een wildtype muis vertegenwoordigt de TCR beta low CD 69 negatieve gate een populatie pre-selectie dubbel-positieve thymocyten. De TCR beta intermediate CD 69 positieve gate vertegenwoordigt daarentegen een transitionele populatie direct na TCR-engagement en bestaat uit dubbel-positieve bright, enkele dubbel-positieve dull en CD 4 positieve CD 8 low cellen. Hier illustreert de TCR beta high CD 69 positieve gate de populatie cellen direct na positieve selectie, die bestaat uit dubbel-positieve dull, CD 4 positieve, CD 8 low en CD 4 enkel-positieve cellen.

Ten slotte vertoont deze TCR beta high CD 69 negatieve gate een rijpere populatie cellen die primair bestaat uit CD4 en CD8 single positive cellen. De afwezigheid van de TCR beta intermediate CD 69 positieve en TCR beta high CD 69 positieve populaties kan duiden op een verstoorde positieve selectie. Veranderingen in de ratio van CD4 single positive ten opzichte van CD8 single positive cellen binnen de TCR beta high CD 69 negatieve populatie kunnen wijzen op wijzigingen in de lineage commitment.

Het verlies van de TCR beta high CD 69 positieve en TCR beta high CD 69 negatieve populaties kan wijzen op overlevingsproblemen na positieve selectie. Het onderzoeken van TCR beta via CD 5 is een andere strategie om populaties vóór en na positieve selectie te identificeren. Deze eerste twee populaties bestaan hoofdzakelijk uit double positive bright thymocyten.

De TCR bèta laag CD5 laag populatie vertegenwoordigt preselectie dubbel-positieve thymocyten, en de TCR bèta intermediair CD5 intermediair populatie bestaat uit de cellen die de positieve selectie initiëren. Een verminderde generatie van deze of de voorgaande populatie wijst op een defecte positieve selectie. De TCR bèta intermediair CD5 hoog populatie vertegenwoordigt echter thymocyten die in het proces van positieve selectie zitten en bestaat primair uit dubbel-positieve dull en CD4-positieve cellen.

CD8-lage thymocyten. De TCR-beta-hoge CD5-hoge populatie bestaat voornamelijk uit post-positieve selectie. Enkelvoudig positieve thymocyten veranderingen in de ratio van CD4-enkelvoudig positief tot CD8.

Enkelvoudige positieve cellen binnen deze populatie, ondanks normale voorafgaande populaties, kunnen wijzen op veranderingen in de lineage commitment. Bovendien kan de afwezigheid van deze populatie duiden op een verminderde overleving van thymocyten na positieve selectie, aangezien negatieve selectie de deletie van kleine antigeenspecifieke populaties omvat. Defecten in dit proces kunnen het beste worden waargenomen met behulp van TCR-transgene muizen; in HY CD4-muizen kunnen thymocyten die het transgene H-Y-T-C-R tot expressie brengen worden gedetecteerd met het monoclonale antilichaam T 3.7.

De H-Y-T-C-R herkent het mannelijk-specifieke HY-antigeen dat wordt gepresenteerd binnen MHC-klasse I db. Hierdoor ondergaan HY CD4 mannelijke muizen negatieve selectie van H-Y-T-C-R-positieve thymocyten, wat wordt aangetoond door een afname in het aantal T 3.70-positieve dubbel-positieve thymocyten, en een nog sterkere afname in het aantal T 3.7-positieve CD8 enkel-positieve thymocyten. In tegenstelling hiertoe ondergaan HY CD4 vrouwelijke muizen positieve selectie om T 3.7-positieve CD8 enkel-positieve T-cellen te genereren.

Hoewel een afname in het aantal dubbel positieve thymocyten duidt op negatieve selectie, is de afwezigheid van antigeenspecifieke enkel positieve thymocyten de meest nauwkeurige maatstaf. Verdere analyse van de weinige T3.70-positieve CD8 enkel positieve thymocyten in HY CD4 mannelijke muizen onthult dat het merendeel CD24-hoge onrijpe cellen zijn. Aangezien de meeste T3.70-positieve CD8 enkel positieve thymocyten in de HY CD4 vrouwelijke muizen de rijpe fase hebben bereikt en CD24-laag zijn, biedt dit verdere ondersteuning voor de stelling dat negatieve selectie plaatsvindt in HY CD4 mannelijke muizen.

Een beperking van de TCR-transgene modellen is dat het moeilijk is om positieve selectie verder te karakteriseren door populaties te identificeren op basis van TCR en CD 69- of CD 5-expressie, vanwege de hoge TCR-expressie gedurende de volledige thymocytontwikkeling. HY CD 4-vrouwmuizen hebben een grote populatie T 3.70-positieve dubbelpositieve thymocyten die positieve selectie ondergaan. Zoals aangegeven door een toename in de CD 69-positieve populatie vergeleken met het wildtype, vereist negatieve selectie een TCR-stimulus met een hogere affiniteit dan positieve selectie. Dit wordt aangetoond door een hogere expressie van CD 69 op T 3.70-positieve dubbelpositieve thymocyten in HY CD 4-mannetjesmuizen, wat resulteert in een verschuiving van de histogrampiek naar rechts.

Vergelijkbare trends worden waargenomen bij de expressie van CD5 wanneer de thymische selectie in genetisch gemodificeerde muizen wordt geanalyseerd. Door de expressie van CD69 of CD5 te onderzoeken, kan worden vastgesteld of het defect in de TCR-signalering ligt of een stroomafwaarts resultaat is van TCR-stimulatie. Zodra de methode onder de knie is, kan deze techniek in twee en een halve uur worden uitgevoerd voor de celpreparatie en kleuring, plus een extra uur voor de gegevensverzameling op de flowcytometer.

Indien correct uitgevoerd, zal elke extra muis ongeveer 30 minuten toevoegen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de thymocyten voorzichtig te behandelen en ervoor te zorgen dat u de kleuringsstrategie vooraf heeft gepland. Volg deze procedure.

Andere assays, zoals killing-assays of cytokineproductie-assays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de geëxporteerde thymocyten correct functioneren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de ontwikkeling van de thymische locaties met behulp van flowcytometrie kan worden geanalyseerd.