Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Het algemene doel van deze procedure is het meten van EEG-gedefinieerde slaap en lactaatconcentratie tijdens optogenetische stimulatie op precieze stereotaxische coördinaten. Implanteer chirurgisch de benodigde elektro-encefalografische leads en canules voor een lactaatsensor en een glasvezelkabel. Voer vervolgens de glasvezelkabel en de vooraf gekalibreerde lactaatsensor in hun respectievelijke geleidecanules in de schedel van het dier in.

Pas vervolgens de intensiteit van de blauwe lichtstimulus aan om de gewenste elektrofysiologische respons te bereiken. Ga daarna over tot het verzamelen van de elektro-encefalografische, elektromyografische en lactaatconcentratiegegevens terwijl het dier spontaan mag bewegen en/of slapen. In vergelijking met andere methoden, zoals farmacologische studies van het EEG, heeft deze experimentele aanpak het voordeel dat de hersenchemie en elektrofysiologie kunnen worden gemonitord terwijl de activiteit van neuronen in realtime op een subseconde tijdschaal wordt gemanipuleerd.

Het potentieel om nieuwe inzichten te verschaffen voor het vakgebied van slaaponderzoek is dus groot. Men kan bijvoorbeeld metabole en elektrofysiologische begeleidende verschijnselen van slow-wave-slaap identificeren. Dit type experiment kan ook worden toegepast in andere gebieden van de neurowetenschappen, zoals leren en geheugen, synaptische plasticiteit of epileptische aandoeningen.

De chirurgische techniek is technisch uitdagend. Het vereist een aanzienlijke mate van behendigheid, maar dit kan door oefening worden bereikt. In deze visuele demonstratie zal ik de kritische stappen van enkele complexe chirurgische procedures herhalen ter aanvulling op de schriftelijke beschrijving.

Zodra een dier is hersteld van de operatie, is de uitdaging om de lactaatmetingssensor en de glasvezelkabel correct in te brengen. Jonathan en ik zullen demonstreren hoe men een stevige grip hanteert bij het fixeren van het dier om deze twee delicate instrumenten in te brengen. Tot slot laten we zien hoe de EEG-respons kan worden geoptimaliseerd door de intensiteit van de stimulus in real-time aan te passen.

Gebruik voor dit experiment transgene muizen die het blauwlichtgevoelige kationkanaal Channelrhodopsin-2 tot expressie brengen in cerebrale corticale neuronen. Anestheseer de muis eerst met 5% isofluraan en 95% zuurstof voor de inductie, terwijl de anesthesie wordt gehandhaafd met 3% isofluraan en 97% zuurstof.

Maak een mediale incisie aan de bovenzijde van de schedel, vanaf tussen de ogen tot aan de achterzijde van de schedel. Reinig de schedel met waterstofperoxide en steriele zoutoplossing. Lokaliseer en markeer Bregma en Lambda om de stereotaxische coördinaten voor de optogenetische stimulusconfiguraties van de elektroden te bepalen. Boor de schroefgaten voor met een hogesnelheids tandartsboor met een bolvormige frees van 0,5 millimeter, gevolgd door een bolvormige frees van 0,7 millimeter.

Draai de kelo gram-schroeven voor de elektroden met een platte handschroevendraaier in de gaten. Draai ze ongeveer vier tot vijf slagen in om de gewenste diepte te bereiken. Houd de geleidecanules op hun plaats met een stereotactische canule en bevestig ze vervolgens aan de schedel en de ankers met acrylcement. Om de doorgankelijkheid te behouden, moet elke geleidecanule vanaf het moment van de operatie tot aan het begin van de experimenten een dummycanule of stylet bevatten.

Zodra de EEG's en geleidecanules in de schedel zijn geplaatst, worden deze met een dunne laag tandheelkundig acrylcement aan elkaar bevestigd. Nadat het cement is uitgehard, wordt de plastic connector boven de gedroogde cementheuvel geplaatst; soldeer de uiteinden van de draden die uit de EEG-leads komen aan de contacten op de plastic connector, voor het geval de draadleidingen in het cement vastzitten. Trek vervolgens de elektromyogramdraden door de nucleaire spieren door ze in de loop van een naald met gauge 21 te schuiven.

Knoop door de spier heen een dubbele chirurgische knoop met een 5-0 nylon hechtdraad rond deze draden, net distaal van het punt waar ze de spier verlaten. Hecht de huid, die was teruggetrokken om toegang te krijgen tot het spierweefsel, weer dicht met enkelvoudige onderbroken chirurgische knopen met behulp van een reverse cutting P3-naald en 5-0 nylon hechtdraad. Zodra de mc-stimulatie-eenheid is geprogrammeerd, dient deze te worden gebruikt als een zelfstandige signaalgenerator met een binair aan-uitsignaal van 5 volt. Verbind de mc-stimulatie-eenheid met de TTL-compatibele voeding van de laser met behulp van BNC-connectoren.

Verbind de laserstroomvoorziening via een lintkabel met de laser. Verbind de laser daarnaast met de mannelijke FC-connector van de oorspronkelijke glasvezelpatchkabel. Verbind de oorspronkelijke glasvezelkabel met de rotatiekoppeling.

De commutator Fiber optic rotary joint dient als commutator. Terwijl het dier zich in zijn kooi beweegt, roteert het rotatiegewricht om breuk van de glasvezelkabels door rotatietorsie te voorkomen. Bevestig de commutator met plastic kabelbinders aan een metalen standaard die boven de cilindrische kooi waarin het dier wordt gehuisvest is geplaatst.

Fixeer de muis door deze met één hand onder een komvormige handpalm te klemmen. Positioneer de kop tussen de middel- en wijsvinger van de experimentator. Reinig vervolgens de geleidecannule van debris met een steriele naald van 25 gauge.

Voer vervolgens de glasvezelkabel handmatig in en bevestig deze aan de glasvezelgeleidende canule met een schroefdop. Controleer de inbrengdiepte van de glasvezelkabel in de hersenen aan de hand van een hechtknoop die op een vaste afstand van het vlakke, geklopte uiteinde aan de glasvezelkabel is geknoopt. De sensor wordt geëquilibreerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing en stapsgewijs blootgesteld aan drie concentraties L-lactaat.

Voeg, volgens de protocollen van de fabrikant, de vooraf gekalibreerde sensor in de op de schedel gemonteerde lactaatgeleidingscanule in op een wijze die identiek is aan de procedure voor het inbrengen van de glasvezelkabel. Verbind de lactaatsensor met de voorversterker van de pinnacle 8, 400 biosensor met bipolaire stekkerconnectoren. Bevestig vervolgens deze voorversterker aan de achtpins connector op de chirurgisch geïmplanteerde hoofdmontage.

Pas vóór het verzamelen van de gegevens de intensiteit van de optogenetische stimulus aan met de regelknop voor laserintensiteit. De amplitude van de EEG-respons varieert tussen dieren door factoren die niet systematisch zijn bestudeerd. Daarom is het noodzakelijk om de intensiteit van de optogenetische stimulus aan te passen en te verifiëren dat de EEG-respons adequaat is wanneer de gewenste respons is bereikt.

Verzamel gegevens met behulp van het Pinnacle 8, 400-systeem met de neuro score. Een SEIA-interface classificeert de slaaptoestanden door visuele inspectie van de EEG- en EMG-gegevensverwerking. De gegevens in epochs van tien seconden worden ingedeeld als waaktoestand, non-rapid eye movement-slaap of rapid eye movement-slaap op basis van het EEG en EMG.

Deze configuratie voor optogenetische stimulatie met biosensoren toont de chirurgisch geïmplanteerde EEG-elektroden, de lactatsensor en de canule voor optogenetische stimulatie. In afwezigheid van optogenetische stimulatie vertoonde deze muis spontane slaap. Overgangen naar de waaktoestand werden gevolgd terwijl de E-E-G-E-M-G en de cerebrale lactaatconcentratie continu werden gemonitord tijdens waakzaamheid en de twee subtypes van slaap.

Rapid eye movement (REM) en non-rapid eye movement (NREM) worden gedefinieerd op basis van het EEG en het EMG. Interessant is dat de stroom van de lactaatbiosensor stijgt als functie van EEG met een lage amplitude en daalt als functie van EEG met een hoge amplitude. Beide kanalen van het EEG reageren op optogenetische stimuli die in de frontale cortex worden toegediend.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een muis chirurgisch kunt implanteren voor gelijktijdige optogenetische manipulatie en meting van het elektro-encefalogram, elektromyogram en de lactaatconcentratie in de hersenen. Zodra deze chirurgische techniek onder de knie is, kan deze correct worden uitgevoerd in 90 tot 120 minuten. Vergeet niet om de ademhaling van het dier constant te monitoren als graadmeter voor de diepte van de anesthesie.

Als het dier minder vaak ademt dan één keer per vier tot vijf seconden, kan de anesthesie te diep zijn. Als het dier vaker ademt dan één keer per twee seconden, kan de anesthesie te licht zijn. Vergeet niet de passende veiligheidsmaatregelen te nemen bij het gebruik van het gasvormige anesthesiemiddel isofluoraan.

Zorg voor adequate ventilatie in de operatiekamer om uw netvlies te beschermen tegen de laser die wordt gebruikt voor optogenetische stimulatie. Draag een beschermbril of plaats het dier in een lichtdichte kast. Het is raadzaam om het implanteren van de lactaatbiosensor en de glasvezelkabel te oefenen bij een volledig wakkere muis.

Muizen werken niet mee aan deze procedures en moeten worden geïmmobiliseerd. De fixatie mag echter niet zo krachtig zijn dat het dier gewond raakt of de ademhaling wordt belemmerd.