Zenden Plant Virussen gebruiken Wittevlieg
8 november 2013
Beter inzicht in en ons vermogen om veel van de insecten overgedragen plantenvirussen beheerder vereist het gebruik van de vector. Insect overdracht van plantenvirussen is een tritrofe interactie, en als zodanig vereist het manipuleren van insecten, virussen, en plant. Vectoren worden gekweekt in grote aantallen en gemanipuleerd op zodanige wijze dat een hoge mate van overdracht op testplanten verzekeren. De basisprincipes van het houden van en het manipuleren van de witte vlieg, Bemisa tabaci ( Hemiptera: Aleyrodidae), Wordt een vector van plantaardige virussen behorend tot verschillende opkomende planten virus geslachten, wat neerkomt op een groot aantal economisch belangrijke virussen gepresenteerd.
Het algemene doel van het volgende experiment is het overbrengen van plantenvirussen met behulp van witte vliegen. Dit wordt bereikt door het opzetten en onderhouden van een kolonie witte vliegen die wekelijks vers uitgevlogen volwassen witte vliegen levert, die niet besmet zijn met andere potentiële vectoren en pathogenen. De kolonies worden onderhouden door regelmatig witte vliegen toe te voegen aan jonge, insectenvrije planten waaraan nieuwe volwassenen worden geproduceerd.
Na 17 tot 20 dagen kan men elke week de pas uitgekomen volwassen exemplaren overbrengen naar testplanten om virusoverdracht te verwerven of over te dragen. Doorgaans worden efficiënties van bijna 100% behaald, waarbij transmissiesnelheden meestal laag beginnen en stijgen door systematische optimalisatie. Het meest uitdagende aspect van het gebruik van witte vliegen voor virusinoculatie is het kweken van de witte vliegen op een manier waarop ongewenste pathogenen en insecten worden uitgesloten.
Pathogenen, in het bijzonder wortelrot-schimmels en bladverbranding, verminderen de kwaliteit van de virusgastplanten. Ongewenste insecten, zoals tripsen, kunnen de reproductie van de wittevlieg onderdrukken en bovendien de kwaliteit van de virusgastplant verslechteren. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Heather Capa Bianco, een technicus uit mijn laboratorium.
Wittevliekolonies moeten worden onderhouden in een schone en gecontroleerde groeikamer. Controle van de relatieve vochtigheid, temperatuur, fotoperiode en lichtintensiteit zijn essentieel voor een kolonie die zich in 18 dagen ontwikkelt van ei tot volwassene; gebruik hiervoor de volgende instellingen. De temperatuur moet worden ingesteld tussen 26 en 30 °C, en de relatieve vochtigheid moet idealiter tussen 30 en 50% liggen. Als de relatieve vochtigheid boven de 70% stijgt, kunnen insecten en schimmelpathogenen van planten waarschijnlijk een probleem vormen.
De ideale fotoperiode is 14 uur. De lichtintensiteit moet vrij hoog zijn; VHO-fluorescentielampen kunnen 800 tot 1000 foot-kaarsen bij het bladerdek van de plant produceren. De hoeveelheden meststoffen en het bewateren moeten tevens worden verminderd om schimmelpathogenen en zoutophoping te voorkomen. Whitely-kooien moeten ventilatie, gemakkelijke toegang en voldoende ruimte voor een groeiende Whitely-populatie mogelijk maken.
Goede resultaten zijn behaald met organza voor organen gecombineerd met aluminium gaas, evenals met witkleurig gaas. De keuze van de plantensoort is een belangrijke overweging. Ten eerste moet de plant snel groeien, maar mag deze de kamer niet overwoekeren. Ten tweede moet de plant sterk genoeg zijn om een hoge insectenpopulatie te ondersteunen zonder in te storten.
Om deze redenen zijn dwerg- of struikcultivars geschikte plantkeuzes. Ten derde moet de plant, afhankelijk van het type kolonie dat wordt opgekweekt, ofwel in staat zijn om het gebruikte virus te huisvesten, of juist niet in staat zijn dit te doen. Omdat de kolonie kan instorten door mijten, THP's, wilde witte vliegen of andere invasieve insecten, moeten de gekozen cultivars worden gekweekt in een beschermde omgeving om andere insecten uit te sluiten.
De eerste witte vliegen van een nieuwe kolonie moeten vrij zijn van plantenvirussen, andere insecten en insectpathogenen. Als witte vliegen in het veld zijn verzameld, moeten ze gedurende ten minste acht weken worden gekweekt op planten die tijdens deze periode geen gastheren voor het virus zijn, waarbij moet worden gecontroleerd op de afwezigheid van plantsymptomen. Zodra schone witte vliegen zijn verkregen, worden er tussen de 20 en 100 exemplaren via aspiratie of door ze voorzichtig van een andere bronplant af te schudden in een kooi met planten geïntroduceerd.
Elke week moet er een nieuwe kooi worden ingericht. Gebruik gedurende de eerste drie weken de wittevliegen op non-ST planten om de nieuwe kooi in te richten. Gebruik vanaf de vierde week jonge volwassen wittevliegen uit de drie weken oude kooi om de volgende kooi in te richten.
Tijdens de eerste week in een kooi zullen de witte vliegen eitjes leggen aan de onderzijde van de bladoppervlakken van de plant. In de tweede week zullen onvolwassen witte vliegen zichtbaar worden en zullen sommige volwassenen nog in leven zijn. In de derde week zullen er veel nieuwe volwassen witte vliegen zijn uitgekomen, en er zou een zeer merkbare toename van de populatie volwassen witte vliegen moeten zijn.
Deze wittevliegen kunnen worden gebruikt voor transmissie-experimenten. In de vierde week moeten de één week oude volwassenen naar een nieuwe kooi worden overgebracht. De oude kooi moet worden verwijderd en de planten erin moeten worden weggegooid. Precies.
Zachte overdracht van witte vliegen wordt uitgevoerd met een aspiratieapparaat en opvangbuisjes; aspireer nooit direct. Witte vliegen die zich voeden met planten zijn tijdens het voeden ingebed in de plant en zullen afbreken als ze van de plant worden weggetrokken, waardoor de witte vlieg onbruikbaar wordt. Om witte vliegen te verzamelen, houdt u met één hand een gele plastic beschermkap in de koloniekooi en met de andere hand het aspiratieapparaat.
Tik voorzichtig tegen de planten om de volwassen witte vliegen te laten wegvliegen. De witte vliegen zullen worden aangetrokken door de gele kaart, waar ze kunnen worden verzameld. Voeg met de aspirator en zeer zachte zuigkracht maximaal 20 witte vliegen toe aan elk verzamelbuisje.
Tik vervolgens op het buisje om de vliegen te desoriënteren en sluit het buisje af met param. Om een succesvolle virale transmissie te waarborgen, worden 15 tot 40 jonge volwassenen overgebracht van virusgeïnfecteerde planten naar gezonde planten, afhankelijk van het virus en de waardplant. Andere protocollen, zoals resistentiescreening, vereisen grotere startpopulaties.
Schud in dit geval de met het virus geïnfecteerde planten, die door witte vliegen zijn aangetast, boven de planten die geïnoculeerd moeten worden. Zodra de witte vliegen op een virusgeïnfecteerde plant zijn geplaatst, laat u ze 48 tot 72 uur voeden om persistent overgedragen virussen te verwerven. Meer tijd verhoogt over het algemeen de transmissiegraad niet voor virussen die op een niet-persistente of semi-persistente wijze worden overgedragen.
Een kortere acquisitieperiode van een uur tot een dag is voldoende voor experimenten waarbij acquisitie uit specifieke bladeren vereist is. Clip-knooppunten kunnen worden gebruikt; stel de kooi zo in dat de onderzijde van het blad toegankelijk is, en gebruik niet meer dan 10 vrouwelijke witte vliegen per kooi met een diameter van 2,5 centimeter, anders zal de transmissiesnelheid dalen door verdringing. Selecteer voor plantinoculatie de geschikte kooi op basis van het aantal planten.
Voor één plant is bijvoorbeeld slechts een kleine kooi nodig die net iets groter is dan de plant zelf; voor meerdere planten kan men kiezen tussen een kleinere PVC-buis, een framekooi of een grotere aluminium framekooi. Hoe kleiner de ruimte rondom het bladerdak van de plant, hoe beter. Zodra de witte vliegen aan de nieuwe plant zijn toegevoegd, hangt de benodigde tijd voor inoculatie af van het virus en de waardplant.
Net als bij de acquisitie is de benodigde tijd voor transmissie afhankelijk van de wijze van transmissie. Niet-persistente transmissie vereist een veel kortere toegangstijd dan semi-persistente of persistente transmissie. Controleer of de wittevliegen aan het proeven of voeden zijn tijdens de inoculatie-toegangsperiode.
Open de kooi en onderzoek de onderzijde van enkele bladeren van elke plant. Tijdens langere inoculatieperioden worden de planten periodiek voorzichtig bewogen om de herverdeling op de planten te stimuleren.
Dit zal de transmissiesnelheid verhogen door de natuurlijke neiging van witte vliegen om te aggregeren aan het einde van de inoculatieperiode tegen te gaan. Dood de witte vliegen met twee opeenvolgend toegepaste insecticiden. Breng eerst een contactinsecticide aan om volwassen witte vliegen snel te bestrijden, zoals insecticidale zeep.
Pas vervolgens een systemisch insecticide toe om eventuele witte vliegen die zich in de volgende weken ontwikkelen, te bestrijden. Voor de resterende volwassen insecten zijn imidacloprid of pyrazofos effectieve keuzes. Met deze procedures is het mogelijk om routinematig virusoverdrachtssnelheden van 100% te bereiken. Zulke hoge overdrachtspercentages zijn essentieel bij het screenen van testplanten op virusresistentie en zijn wenselijk bij het evalueren van de effectiviteit van chemische verbindingen wat betreft hun vermogen om virusoverdracht te belemmeren.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe witte vliegen gekweekt kunnen worden en hoe ze kunnen worden gebruikt om plantenvirussen over te dragen. Deze procedures kunnen worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, voor de commerciële ontwikkeling van virusresistente planten, of voor het testen van verbindingen op hun vermogen om virusoverdracht te beïnvloeden.
Overzicht
Deze studie richt zich op de overdracht van plantenvirussen via de wittevlieg, Bemisia tabaci. Er wordt gedetailleerd beschreven hoe wittevliegen in een gecontroleerde omgeving worden gekweekt om hoge transmissiepercentages van virussen naar testplanten te waarborgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantenvirussen
- Beheer van insectenvectoren
- Entomologie
Achtergrond
- De overdracht van plantenvirussen door insecten omvat complexe interacties tussen insecten, virussen en planten.
- Wittevliegen zijn belangrijke vectoren voor diverse economisch relevante plantenvirussen.
- Een succesvolle virusoverdracht vereist een zorgvuldig beheer van de wittevliegkolonies.
- Contaminatie door pathogenen en andere insecten kan de kwaliteit van de experimenten in gevaar brengen.
Doel van de studie
- Het vaststellen van effectieve methoden voor het fokken van witte vliegen voor virusoverdrachtsexperimenten.
- Het optimaliseren van de omstandigheden voor hoge percentages virusoverdracht naar testplanten.
- Het demonstreren van de procedures voor het onderhouden van gezonde kolonies witte vliegen.
Gebruikte methoden
- Opzetten van wittevliegkolonies in gecontroleerde groeikamers.
- Regelmatige overdracht van pas uitgekomen volwassenen naar testplanten.
- Monitoring van omgevingscondities zoals luchtvochtigheid, temperatuur en licht.
- Gebruik van specifieke plantencultivars om wittevliegpopulaties en virusoverdracht te ondersteunen.
Belangrijkste resultaten
- Met systematische optimalisatie werden transmissiepercentages van bijna 100% bereikt.
- Het handhaven van schone omstandigheden verminderde het risico op contaminatie aanzienlijk.
- Er werden specifieke protocollen opgesteld voor het overbrengen en beheren van witte vliegen.
- Succesvolle virusverwerving en transmissie werden aangetoond met behulp van jonge volwassen witte vliegen.
Conclusies
- Een effectieve kweek en het beheer van witte vliegen zijn cruciaal voor succesvolle studies naar de transmissie van plantenvirussen.
- Gecontroleerde omgevingscondities verbeteren de kwaliteit en betrouwbaarheid van de experimenten.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methoden om andere interacties tussen planten, virussen en vectoren te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het vestigen van betrouwbare wittevliegkolonies maakt een consistente overdracht van plantenvirussen mogelijk voor het screenen van antivirale verbindingen en resistentievuulprogramma's. Een hoogefficiënte transmissie ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's bij therapeutische kandidaten op basis van planten. Deze methode biedt een schaalbaar, reproduceerbaar systeem voor het evalueren van virus-gastheerinteracties in vroege discovery-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om virus-gastheer-pathogeeninteracties te onderzoeken om mechanistische routes bij de overdracht van plantenvirussen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door een gecontroleerd vectorsysteem te bieden voor functionele targetvalidatie.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage via gestandaardiseerde virusinoculatie voor resistentiescreening en het testen van de effectiviteit van verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream antivirale screening met kwantificeerbare transmissiemetingen.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via protocollen voor kolonieonderhoud die variabiliteit minimaliseren.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform en opschaling mogelijk voor high-throughput evaluatie van chemische inhibitoren of resistente cultivars.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt virusoverdrachtstudies in de ontdekkingsfase met de preklinische evaluatie van resistentiekenmerken of antivirale verbindingen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door een consistente virusafgifte over verschillende experimentele condities aan te tonen.
- Mechanistische risicoreductie: Richt zich op de voorspellende waarde bij het begrijpen van determinanten van transmissie-efficiëntie voor de ontwikkeling van antivirale middelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Positioneert virusoverdracht via witte vlieg als een enabling technology van ontdekking tot preklinische fase voor de validatie van antivirale targets en de elucidatie van resistentiemechanismen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van mechanismen voor virusverwerving en inoculatie via gecontroleerde vectorblootstelling.
- Screening: Levert assay-klare systemen met een hoge transmissie-efficiëntie voor betrouwbare evaluatie van verbindingen of genotypen.
- Analytiek: Levert kwantitatieve output van transmissiesnelheden die vergelijking van antivirale effectiviteit of resistentiepenetrantie mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug van vroege ontdekking naar preklinische validatie door consistentie van virusoverdracht te waarborgen in pijplijnen voor resistentievriendelijke veredeling.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar vectorplatform dat toepasbaar is op meerdere virus-gastheersystemen in de landbouwbiobiotechnologie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in studies naar virustransmissie te verminderen.
- Operationele waarde: Biedt standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gedefinieerde protocollen voor kolonieonderhoud en overdracht.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het biologische risico in antivirale screeningscampagnes te verlagen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van resistentiekenmerken of verbindingen mogelijk op basis van consistente gegevens over virusuitdagingen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in entomologie, plantvirologie en steriele technieken voor de integriteit van de kolonie.
- Is afhankelijk van gecontroleerde groeikamers met nauwkeurige regeling van temperatuur, vochtigheid, verlichting en ventilatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de hanteer-, aspiratie- en transferprocedures van tripsen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij verschillende virus-gastheercombinaties en biotypes van tripsen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de uitsluiting van pathogenen, parasitoïden en concurrerende insecten om de zuiverheid van de kolonie te behouden.
