Appetitieve Associatieve Olfactorische Learning in

Het doel van deze procedure is het analyseren van hogere hersenfuncties. In een eenvoudig model wordt dit bij DFA-larven onderzocht via eetlust en associatief olfactorisch leren. Dit wordt bereikt door eerst 30 gevoede larven in het derde stadium uit een voedingsbuisje te verzamelen.

Vervolgens worden de larven vijf minuten getraind op een Petrischaal met fructose als beloning en aan elke zijde een geurcontainer die octanol bevat als olfactorische stimulus. Daarna volgt een tweede trainingsfase van vijf minuten op een schaal zonder fructosebeloning en met geurcontainers aan beide zijden die amylacetaat bevatten. Na drie herhalingen van deze twee trainingsfasen worden de larven gedurende een test van vijf minuten zonder beloning blootgesteld aan geurcontainers aan tegenovergestelde zijden.

Uiteindelijk geeft de relatieve geurvoorkeur van één octanol ten opzichte van amylacetaat aan dat drosophila-larven een associatie kunnen vormen tussen olfactorische stimuli en een suikerbeloning, en dat dit gebruikt kan worden om associatief leren te bestuderen in een genetisch flexibel systeem. Deze methode, in combinatie met genetische interferentie van de neurale functie, kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van leren en geheugen, zoals welke neuronen de beloning signaleren, of welke neuronen noodzakelijk of voldoende zijn voor de acquisitie of het ophalen van een repetitief geheugen? Het demonstreren van de procedure zal anti a postop zijn.

Een promovendus uit mijn laboratorium maakt eerst 2,5% aros Petri-schalen zonder fructose. Om de fructose-schalen te bereiden, wordt de fructose toegevoegd aan de opgeloste aros, waarna het mengsel in de schaal wordt gegoten. Vervolgens wordt elke schaal gelabeld met een verschillend symbool om de experimentator te blinderen.

Het schaaltje met fructose is de conditioneringsbeloning en het lege schaaltje is de niet-beloning. Bereid voor de conditioneringsstimuli in totaal drie aangepaste Teflon-geurbekers voor met 10 µL pure 1-octanol. De deksels zijn voorzien van kleine gaatjes om verdamping van de geur mogelijk te maken.

Bereid vervolgens nog drie geurcontainers voor met 10 µL amylacetaat, verdund in een verhouding van 1:50 in paraffine-olie. Deze verdunning is even aantrekkelijk als de 10 µL pure octanal; begin met het verzamelen van 30 vliegen die voedend zijn en niet dwalen, vanuit een voedingsbuisje.

Dit protocol kan op elk moment van de dag worden uitgevoerd. Het is onafhankelijk van circadiane ritmes. Breng de larven over naar een petrischaal met een paar druppels kraanwater en beweeg ze voorzichtig met een penseel heen en weer.

Breng de larven vervolgens over naar een tweede Petrischaal waarin ook enkele druppels kraanwater aanwezig zijn. Controleer de larven op voedingspasta op hun lichaamswanden. Plaats de Petrischaal nu in de experimentele opstelling om de larven te trainen geuren te associëren met een specifieke suikersignaal.

Plaats een geurcontainer aan de linker- en rechterzijde van een van de twee typen schaaltjes die als stimuli worden gebruikt. Hier is een octaal schaaltje gebruikt, maar de keuze is willekeurig aangezien de experimentator blind is voor de beloning. Plaats vervolgens de groep larven in het midden van het schaaltje.

Sluit het deksel en wacht vijf minuten terwijl de dieren worden blootgesteld aan de stimuli. Zorg ervoor dat de larven de oppervlaktespanning van de waterdruppel kunnen overwinnen, zodat ze niet vast komen te zitten en vrij kunnen verkennen. Plaats een nieuwe container met Amal-acetaat op een schone Petrischaal.

Gebruik na vijf minuten een vochtig penseel om de larven over te brengen naar het type schaal met de tegenovergestelde stimuli aan de linker- en rechterzijde. De geur is hier amal acetate. Sluit na het overbrengen van de larven het deksel en laat de dieren vijf minuten lang exploreren.

Wanneer deze tijd is verstreken, is de eerste trainingsronde voltooid. Voer op dezelfde wijze als bij de eerste ronde nog twee extra trainingsrondes uit. Verplaats de dieren met een vochtig penseel en stel ze in totaal drie keer bloot aan elke combinatie van stimulus en beloning.

Plaats voor de experimentele test verse geurcontainers, één van elk stimulus, op tegenovergestelde zijden van een onbehandelde agar-Petrischaal. Verplaats de getrainde dieren naar het midden van de schaal. Sluit het deksel en wacht vijf minuten.

Gebruik na vijf minuten een sjabloon onder de schaal waarin drie zones (links, rechts en midden) duidelijk zijn afgebakend om het aantal larven in elke zone te tellen. De middelste zone staat voor een score van geen voorkeur, wat de analyse restrictiever maakt en minder onderhevig is aan bias. Selecteer ten slotte om het experiment te voltooien 30 nieuwe larven in het derde stadium van voeding en herhaal de training en testen met de tegenovergestelde combinatie van beloning en stimuli.

Gebruik dezelfde geurcontainers verder. Verschillende controleproeven zijn nodig om vast te stellen of transgene dieren een normale geurverwerking hebben voor de beloningsstimuli. De test voor naïeve geurvoorkeur begint met het verzamelen en wassen van 30 larven, op dezelfde wijze als bij de training en het testen.

Plaats vervolgens de larven op een agro rose Petri-schaal met slechts één stimulusflesje aan één zijde. Sluit het deksel en wacht vijf minuten. Tel vervolgens, met behulp van het sjabloon, het aantal larven aan de nabije zijde, in het midden en aan de verre zijde van de schaal ten opzichte van de stimulus.

Voer deze test uit voor elke stimulus die in het experiment wordt gebruikt om de naïeve suikerpreferentie te testen. Bereid halve-halve petrischalen voor door de helft van de agar van een standaard schaal uit te snijden en de lege ruimte te vullen met gesmolten agar van het andere type. Zorg ervoor dat beide helften gelijk zijn in volume en dat er geen scherpe scheidingslijn ontstaat.

Dit kan oefening vereisen met de half-half schaal die is voorbereid en op kamertemperatuur is, geplaatst 30 naïef, schoongeveegd na het voeden. Plaats vervolgens de sterlarven in het midden van de schaal. Sluit het deksel en wacht vijf minuten.

Tel vervolgens, met behulp van de mal, het aantal larven aan beide zijden en tel de larven in het midden. De beschreven procedure werd gebruikt om trenchgenetische larven te trainen en te testen. Met gebruik van de voorbeeldstimuli werden de gegevens bijgehouden als het aantal larven in verschillende regio's van de Petrischalen.

Na vijf minuten buiten deze datapreferentie werden indexen berekend en werden prestatie-indexen afgeleid van de wederkerig getrainde groepen. Omdat de geteste larven transgeen waren, werd er ook een keuze aangeboden tussen een gevulde geurcontainer en lucht, evenals een keuze tussen pure geuren en geuren plus een suiker. Een onderzoek van de berekende indexen in een boxplot onthulde dat de dieren in staat waren te leren onderscheid te maken tussen één octanol en ML-acetaat met fructosegeuren als appetitieve versterker.

De dieren herkenden beide stimuli als attractanten en vertoonden een naïeve voorkeur voor fructose-geur boven watergeur. Dit experimentele paradigma is met succes toegepast bij een grote verscheidenheid aan olfactorische en visuele stimuli, evenals een breed scala aan belonende en bestraffende stimuli. Dit paradigma, in combinatie met de vele krachtige genetische manipulaties die beschikbaar zijn in drosophila, is bijzonder nuttig bij het ontleden van neurale netwerken; zo kan bijvoorbeeld de functionele rol van specifieke sets neuronen in het leerproces van de eetlust worden beoordeeld door deze neuronen, gedefinieerd door gal4-expressiepatronen, genetisch te manipuleren.

Deze procedure kan, samen met genetische interferentie van de neuronale functie, worden gebruikt om de neurale netwerken van het larvale brein die betrokken zijn bij leren en geheugen te analyseren. Vanwege de eenvoud van het larvale brein kan dit worden gerealiseerd tot op het niveau van individuele cellen.