Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van de knockdown van ACF1 of SNF2H op E4- of f4-geïnduceerde celdood te observeren. Dit wordt bereikt door de generatie van cellijnen waarin de expressie van ACF1- of SNF2H-srna conditioneel wordt geactiveerd door toevoeging van doxycycline, wat in een tweede stap leidt tot verlaagde spiegels van ACF1- of SNF2H-eiwit. Cellen van de verkregen cellijnen worden behandeld met doxycycline om de expressie van ACF1 of SNF2H te verminderen of blijven onbehandeld.

Vervolgens wordt E4orf4 tot expressie gebracht in cellen met of zonder shRNA-resistente ACF1 of SNF2H. Om het effect van ACF1 of SNF2H op door E4orf4 geïnduceerde celsterven te onderzoeken, zijn resultaten verkregen die de impact van ACF1- of SNF2H-niveaus op de toxiciteit van E4orf4 laten zien, gebaseerd op het tellen van kernen met een apoptotische morfologie middels de JY-assay. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals transiënte transfectie van RNA's, is dat alle cellen het shRNA tot expressie brengen en het percentage cellen dat dit samen met een traditioneel plasmide tot expressie brengt hoger is. Deze methode biedt inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan door E4orf4 geïnduceerde celsterven, maar kan ook worden toegepast op de studie van andere pro-apoptotische eiwitten.

Naast Ana Lafe zal een onderzoeker uit mijn laboratorium delen van deze procedure demonstreren. Om te beginnen met de procedure voor het genereren van induceerbare cellijnen, zaait u T-Rex 2 9 3 cellen uit bij een dichtheid van ongeveer 5 × 10⁶ cellen per 10 cm plaat in 8 mL DMEM met serum zonder tetracycline en met 5 µg/mL blasticidine. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO₂. Vervang de volgende dag het medium door 8 mL vers medium vóór de transfectie. Het plasmide voor transfectie is het P superior neo plus GFP-plasmide dat ACF1 of SNF2H shRNA codeert, aangestuurd door een tetracycline-induceerbare H1-promotor, evenals het neomycine-resistentiegen gefuseerd aan GFP en aangestuurd door een constitutieve PGK-promotor.

Voeg 10 µg plasmid DNA toe aan 500 µL 150 mM natriumchloride en vortex. Voeg vervolgens het jet PY-reagens toe in een hoeveelheid van 2 µL per µg DNA aan een andere buis met 500 µL 150 mM natriumchloride en vortex. Voeg de jet pie-oplossing toe aan het DNA en meng goed door te vortexen.

Incubeer dit 15 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer na 15 minuten voorzichtig de DNA-complexen op de platen van 10 centimeter met een confluentie van 70 tot 80%. T-Rex 2 9 3 cellen vormen de volgende dag een mengsel.

Vervang het medium door een selectief medium, in dit voorbeeld DMEM zoals eerder beschreven, met 500 µg/mL G418. Monitor de cellen gedurende de volgende twee weken. Vervang het selectieve medium elke drie tot vier dagen door een soortgelijk vers medium totdat er kolonies verschijnen.

Identificeer de koloniën met het blote oog en markeer hun locatie op de onderkant van de plaat met een gekleurde stift. Verifieer onder de microscoop of de koloniën goed gescheiden zijn. Koloniën kunnen worden geïsoleerd zodra ze groot genoeg zijn om zonder microscoop zichtbaar te zijn.

Voor het succes van deze procedure is het belangrijk om goed gescheiden kolonies te kiezen tijdens de kolonie-isolatie. Zuig in een steriele zuigkast het medium van de plaat af. Spoel voorzichtig met PBS en zuig alle resterende vloeistof grondig af.

Voeg drie µL 0,25% tripsin in EDTA toe aan één kolonie op de plaat door herhaaldelijk met de tripsine te pipetteren totdat de cellen loslaten van de plaat. Draag de cellen over naar selectief medium in een well van een 24-wells plaat. Herhaal dit voor verschillende andere kolonies op de plaat.

Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 totdat ze de put vullen. Verdeel vervolgens de cellen van elke oorspronkelijke kolonie over drie putten in een aparte 12-wells plaat en incubeer deze tot de volgende dag. Vervang het medium in één plaat door medium dat 1 µg/mL doxycycline bevat uit een stockoplossing bereid in dubbel gedestilleerd water.

Vervang het medium in een controleplaat door medium zonder doxycycline. Incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Cellen uit één behandelde en één onbehandelde put worden vervolgens geoogst voor western blot-analyse om de efficiëntie van de knockdown van ACF1 of SNF2H te bepalen; een representatief resultaat wordt hier getoond.

Deze blot werd gekleurd met antilichamen tegen SNF2H en alfa-tubuline. Dat laatste diende als ladingscontrole voor twee van de klonen. Kloon nummer vier en nummer vijf vertoonden een sterke reductie van SNF2H na inductie met doxycycline en zijn daarom gekozen voor gebruik in het knockdown-experiment, dat in het volgende segment zal worden gedemonstreerd.

De onbehandelde cellen in de derde plaat zullen worden gebruikt om de geselecteerde cellijn uit te breiden, waarna aliquoten van deze cellen zullen worden ingevroren. Voor verder gebruik om knockdown van ACF1 of SNF2H te induceren in cellen op 10 centimeter platen in selectief medium, voeg doxycycline toe in een concentratie van 1 µg/mL aan de helft van de platen en incubeer deze bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 tot 72 uur. Elke groep platen moet voldoende cellen leveren voor 12 platen van 6 centimeter, inclusief twee duplicaten voor de DPI-assay voor elk punt, evenals één plaat voor western blot-analyse van elk monster.

48 tot 72 uur na inductie worden de cellen van elke celgroep met trypsine losgemaakt en, na het tellen, worden 1,5 × 10⁶ cellen per plaat van 6 cm geplaatst in hetzelfde medium, met of zonder doxycycline. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2. Transfect de cellen de volgende dag zoals aangegeven.

Zowel de onbehandelde als de met doxycycline behandelde cellen worden in drievoud op vier manieren getransfecteerd. Eén met een leeg plasmide en een plasmide dat GFP tot expressie brengt; twee met het lege plasmide evenals een vector die SHRA-resistent ACF1-GFP of SNF2H-GFP tot expressie brengt; drie met een plasmide dat E4 codeert, of vier met een plasmide dat GFP tot expressie brengt en met het plasmide dat E4 codeert, alle vier, en de vector die SHRA-resistent ACF1-GFP of SNF2H-GFP tot expressie brengt. Incubeer na transfectie alle platen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Haal op de dag na de transfectie van de cellen de eiwitten uit één plaat per monster voor Western blot-analyse om vast te stellen dat ACF1 of SNF2H efficiënt is uitgeschakeld en dat E4orf1 gelijkmatig tot expressie is gekomen in de verschillende monsters. De overige 16 platen worden gebruikt voor de DPI-assay. Aspireer het medium uit de platen die bedoeld zijn voor de DPI-assay en was de cellen voorzichtig met PBS in een chemische zuurkast.

Voeg één milliliter 4% paraformaldehyde, geprepareerd in PBS, toe om de cellen te bedekken en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden. Zuig de paraformaldehyde af en was met PBS door vijf minuten bij kamertemperatuur te schudden. Herhaal de wasstap nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten. Na de derde PBS-wasstap wordt 80% ethanol, bewaard bij -20 °C, toegevoegd en wordt er gedurende ten minste één uur geïncubeerd bij -20 °C.

Zuig de ethanol af en was de cellen twee keer met PBS onder schudden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten per keer; was daarna één keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met PBS dat 0,5% BSA en 0,05% Tween 20 bevat, ofwel PBS-T. Doe dit ook onder schudden om aspecifieke antilichaamsbinding te voorkomen. Blokkeer de cellen in één milliliter PBS-T-buffer met 10% geiten serum gedurende 20 minuten onder schudden bij kamertemperatuur.

Was daarna de cellen twee keer in P-B-S-B-T, vijf minuten per wasbeurt. Incubeer de cellen met het primaire antilichaam, in dit geval een E4- of E4-specifiek antilichaam, in één milliliter P-B-S-B-T gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudden. Was vervolgens twee keer in P-B-S-B-T en één keer in PBS met 0,1% BSA, vijf minuten per wasbeurt.

Voeg vervolgens één milliliter PBS 0,1% BSA toe aan de cellen, bevattend het juiste fluorescent gelabelde secundaire antilichaam en 0,5 µg/mL van de uiteindelijke concentratie DPI; incubeer dit gedurende 40 minuten onder schudding bij kamertemperatuur in het donker. Was tot slot vijf minuten met PBS.

Droog de put door aspiratie en bewaar de platen nog een uur tot een nacht ondersteboven om volledige droging te bereiken en dek deze af met aluminiumfolie. Monteer dekglasplaatjes op de cellen met behulp van flora Mount G-oplossing. Bewaar de platen bij vier graden Celsius in het donker tot het tijd is om te tellen. De apoptotische celkernen die de verschillende behandelingen ondergingen zoals beschreven in het protocol, werden gefixeerd en gekleurd met E4- of E4-specifieke antilichamen en DPI om de kernen van getransfecteerde cellen te visualiseren.

Deze figuur toont een voorbeeld van cellen die E4orf4 en GFP tot expressie brengen; paneel A toont alleen de controle-expressie van GFP-eiwit, en paneel B toont de expressie van E4orf4. DAPI-gekleurde kernen worden getoond in paneel C en de samengevoegde beelden worden getoond in paneel D. De witte pijlen markeren GFP- en E4orf4-getransfecteerde cellen met kernen met een apoptotische morfologie. Rode pijlen markeren kernen met onregelmatige vormen die niet als apoptotische kernen worden geteld; asterisken markeren mitotische kernen of kernen die zojuist zijn gedeeld. Het aantal gecondenseerde of gefragmenteerde kernen, gevisualiseerd door DAPI-kleuring, werd geteld om het percentage kernen met apoptotische morfologie binnen de getransfecteerde celpopulatie te berekenen om de optimale objectiviteit van de test te waarborgen.

Het tellen van apoptotische kernen in de verschillende monsters werd blind uitgevoerd, waarbij de persoon die telde niet op de hoogte was van de identiteit van het monster. Een representatief resultaat wordt getoond in deze grafiek. Hogere percentages kernabnormaliteiten werden waargenomen in E4F4-expresserende cellen, wat bevestigt dat E4F4 celdood induceert. Het hoogste percentage kernabnormaliteiten werd waargenomen in E4F4-expresserende cellen waarbij de niveaus van ACF1 waren verlaagd door SHR en RNA-gemedieerde knockdown, wat aangeeft dat ACF1-knockdown de door E4F4 geïnduceerde celdood versterkt en de E4F4-toxiciteit in cellen verhoogt.

De expressie van lage niveaus van ACF 1 resulteerde niet in een toename van E 4 of 4 niveaus, zoals te zien is in de Western blot. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een nauwkeurige telling van de apoptotische kernen met DPI te faciliteren en strikte criteria toe te passen voor de identificatie van deze kernen. Naast deze procedure kunnen andere methoden, zoals clonogene assays, worden uitgevoerd om de resultaten van de DA pse na deze procedure te valideren.

Andere methoden, zoals co-immunoprecipitatie-assays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld of er een fysieke interactie bestaat tussen de onderzochte eiwitten.