Trans-vivo Vertraagd Type Overgevoeligheid Assay voor Antigen Specifieke Verordening

Het algemene doel van deze procedure is om de trans vivo DTH-assay te gebruiken om zowel pro- als anti-inflammatoire antigeenspecifieke responsen bij menselijke proefpersonen te monitoren. Isoleer eerst perifere mononucleaire bloedcellen uit het perifere bloed van de menselijke proefpersoon. Meng vervolgens de PBMC-preparatie met PBS.

Recall-antigeen testantigeen en testantigeen plus recall-antigeen. Ga verder met de prem-metingen van de voetkussentjes en injecteer de bereide mengsels in skid-muizen. Herhaal de metingen van de voetkussentjes 24 uur later. Drie.

Definitieve patronen van DTH-responsen kunnen regulatoir, niet-regulatoir en gesensitiseerd zijn. De trans vivo vertraagde type hypersensitiviteitsassay kan worden toegepast om klinische parameters zoals allo-reactieresponsen te bepalen, waarbij de bron van het antigeen de cellen van de transplantatiedonor zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande in vitro methoden is dat men met één assay-systeem gemakkelijk zowel pro-inflammatoire als regulatoire responsen op allo-antigenen, auto-antigenen of tumorantigenen kan detecteren.

Egon, een onderzoeker in mijn laboratorium, zal nu de procedure demonstreren. Gebruik vers menselijk perifeer bloed dat is afgenomen in acid citrate dextrose-buizen om plaatjesactivatie te voorkomen. Isoleer PBMC met behulp van een lymfocyten-scheidingsmedium volgens standaardmethoden. Was de PBMC-preparatie met PBS om contaminerende bloedplaatjes te verwijderen.

Indien er een merkbare contaminatie met rode bloedcellen is, voer dan lysis van de rode cellen uit met behulp van een CK-lysisbuffer. Voer vervolgens nog twee wasbeurten uit met PBS Resus. Suspendeer de PBMC in PBS met een concentratie van 10 miljoen PBMC per milliliter voor het allo-antigeen.

Begin met P BMC's, geïsoleerd uit het perifere bloed van de donor met behulp van de eerder getoonde procedure. Suspendeer vervolgens de donorcellen in PBS tegen een concentratie van 120 miljoen cellen per milliliter en voeg één micromol PMSF toe om proteinedegradatie te voorkomen.

Sonicer nu de celsuspensie met zeven pulsen van één seconde met een sonicator met een probe van twee millimeter. Verifieer met behulp van een hemocytometer of meer dan 90% van de cellen is gedisrumpeerd.

Centrifugeer het mengsel vervolgens gedurende 20 minuten bij 14.000 RPM bij vier graden Celsius. Draag het supernatant zorgvuldig over naar een safe-lock tube en bepaal de eiwitconcentratie voor elke injectie via standaardmethoden. Verdeel zeven aliquots van 10⁶ PBMC's in twee milliliters.

Pellet de cellen door centrifugatie in safe-lock buisjes. Bereid eerst de negatieve controlesuspensie van PBMC voor in 35 µL PBS. Voeg vervolgens voor de positieve controle 25 µL van een recall-antigeen toe (tetanus-toxoïde, difterie-toxoïde) en vul het injectievolume aan tot 35 µL met PBS.

Conform het experimentele ontwerp voor het evalueren van de donorspecifieke respons, wordt het celpellet改めて gesuspendeerd in 10 µL donorantigeen plus 25 µL PBS voor een totaalvolume van 35 µL. Voor het evalueren van de experimentele donorspecifieke regulatie van het antigeen, wordt het celpellet gesuspendeerd in 35 µL door 10 µL donorantigeen en 25 µL recall TT DT-antigeen toe te voegen. Na het anesthetiseren van de skid-muis met isofluoraan, wordt een veerbelaste schuifmaat in het midden van een voetzool geplaatst, waarbij één rand de laatste loopkussentje van de voet raakt om een referentiepunt te bieden zodat de meetlocatie consistent blijft wanneer de meteruitslag is gestabiliseerd.

Registreer de baseline-dikte van het voetkussen voor de injectie in het voetkussen. Plaats de spuit met de naald in de richting van de tenen en de schuine zijde van de naald naar boven gericht. Begin nu met de subcutane injecties van elke celсусpensie in de achtervoetkussens van de muis.

Ten eerste, injecteer langzaam de rechtervoetkussen met de negatieve controlepreparaat. Injecteer vervolgens de linkervoetkussen met de positieve controle van PBMC plus TT dt. Plaats de muis nu terug in de kooi.

Ten tweede, injecteer de rechtervoetzool met PBMC plus allo-antigeen en de linkervoetzool met PBMC plus allo-antigeen plus TT dt. Controleer of er geen lekkage optreedt ongeveer 18 tot 24 uur na de injectie. Anestheseer elke muis met isofluoraan en herhaal de meting van de zwelling van de voetzool.

Trek de dikte van elke voetkussentje vóór de injectie af van de waarde na de injectie om de zwelling van het voetkussentje te bepalen. Bereken vervolgens de antigeenspecifieke netto zwelling door de zwellingwaarde van het controlevoetkussentje af te trekken van de zwellingwaarden verkregen uit de behandelingen. Verifieer de positieve controlemeting op een positieve controlerespons voor het recall-antigeen TT DT van groter dan of gelijk aan 25 × 10⁻⁴ inches.

Een achtergrondrespons op PBS is vereist om de test als geldig te beschouwen. Bepaal vervolgens de inhibitie van recall-responsen in aanwezigheid van donorantigenen. Dit experiment evalueert nier transplantatieontvangers op donorantigeen-specifieke respons en regulatie.

Er zijn drie hoofdpatronen van vertraagde type overgevoeligheid bij transplantatieontvangers: regulerend, niet-regulerend en gesensitiseerd. Alle patiënten reageerden sterk op de positieve controle van het recall-antigeen tt. Patiënt nummer 62 vertoont het regulerende patroon, dat wordt gekenmerkt door een zwakke respons op het donorantigeen en een duidelijke gekoppelde onderdrukking van de respons op het recall-antigeen in aanwezigheid van het donorantigeen.

Dit is het patroon dat geassocieerd is gebleken met tolerantie van orgaanallo-transplantaten. Patiënt nummer 48 vertoont een niet-regulatief patroon, dat gekenmerkt wordt door een zwakke respons op de donor, maar zonder gekoppelde suppressie. Dit patroon is frequent waargenomen bij patiënten die immunosuppressiva gebruiken.

Patiënt nummer acht vertoont het patroon van donor-sensitisatie, gekenmerkt door een hoge respons op donorantigeen en geen gekoppelde suppressie. Deze respons is geassocieerd met graftafstoting. In klinische casestudy's werden P BMC's van proefpersonen die deelnamen aan een observationele studie geanalyseerd op donor-specifieke indirecte route, T-effector- en T-regulatoire responsen om de rol van donor-specifieke regulatie bij klinische tolerantie te evalueren.

De indirecte T-celrespons op donorantigenen onthult een duidelijk spectrum over de verschillende inclusiegroepen. De zwelling van de voetzool neemt toe naarmate de klinische status van de patiënt verschuift van tolerantie naar chronische afstoting. Hierbij meet de gekoppelde suppressie-assay de anti-donor indirecte route van de regulatoire T-celrespons.

Deze gegevens tonen een afname van de regulatoire responsen over het bereik van de meest tolerante patiënten via intermediaire tot de minst tolerante patiënten met chronische afstoting. Samen genomen lijkt immuunregulatie, zoals gemeten door de trans vivo DTH-assay, een belangrijk mechanisme te zijn voor de acceptatie van een renale allograft.

Een veelbelovend gebied is de toepassing van de TDTH-assay bij het monitoren van autoimmuniteit. Ons onderzoek naar de rol van collageen type vijf in het pathologische proces van bronchiolitis OBL-syndroom onthulde dat het hoogste relatieve risico op de ontwikkeling van BOS werd waargenomen bij patiënten met een positieve respons op collageen vijf pbmc van longtransplantatieontvangers, maar niet bij gezonde controles of collageen.

Vier patiënten met het reactieve good pasture-syndroom na een niertransplantatie waren frequent reactief voor collageen vijf. De TDTH-assay kan ook worden gebruikt om de reactiviteit van pbmc van kankerpatiënten op tumorspecifieke antigenen te testen. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van PAP-specifieke T-regulatoire cellen bij prostaatkankerpatiënten kan de respons op vaccinatie met het PAP-antigeen beperken.

De TRANSVAAL DTH-assay is een nieuwe diagnostische test met klinische toepassing bij het beoordelen van celgemedieerde immuunresponsen bij transplantatie-, kanker- en auto-immuunpatiënten. De test is waardevol omdat deze niet alleen nuttig is voor het monitoren van effector t-recallresponsen, maar ook kan worden gebruikt om T-regulatoire responsen te detecteren, aangezien deze niet afhankelijk is van een specifieke cytokinenmeting voor het detecteren van effector- of regulatoire T-cellen. De assay is zeer flexibel en breed toepasbaar.