Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer's
31 maart 2013
Cilia-gegenereerde vloeistofstroom in Blaasjes Kupffer's (KV) regelt links-rechts patroonvorming van de zebravis embryo. We beschrijven een techniek voor het moduleren genfunctie specifiek in KV cellen. Verder tonen we hoe fluorescerende kralen leveren in KV om vloeistofstroming visualiseren.
Het doel van deze procedure is om de functie van genen in de Kavas-blaasjes of de KV in de zebravis-embryo te moduleren, die verantwoordelijk is voor het patroon links-rechts, en asymmetrische vloeistofstroming te analyseren die wordt gegenereerd door motiele cilia door het leveren van fluorescerende kralen in de kv. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende morph-oligonucleotiden te injecteren die de expressie van een specifiek gen van belang onderdrukken in de dooiercel van een embryo in het midden van de blaasholte Dilla-stadium, zodat ze in dorsale voorlopercellen worden geladen die de kv vormen. Vervolgens worden embryo's geselecteerd die alleen fluorescente morphos in de dooiercel en de kv hebben voor verdere analyse.
Vervolgens worden de embryo's gemonteerd op depressieschuifjes en worden fluorescerende kralen geïnjecteerd in het vloeistofgevulde blaasjeslumen van de kv. Ten slotte wordt videomicroscopie gebruikt om kralen te registreren die binnen de kv stromen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die bepalen of weefselspecifieke depletie van een kandidaatgen in de KV asymmetrische vloeistofstroming verandert door middel van kwantitatieve analyse van kralenbewegingen.
Virale demonstratie van dit semester is cruciaal, aangezien stadiumspecifieke molino-injecties en fluoresceine-kralen-injecties moeilijk te leren zijn omdat beide afhankelijk zijn van het positioneren van het embryo en het ontwikkelingstijdstip van het experiment. Om globale morph- of MO-injecties uit te voeren, verzamel embryo's direct na de bevruchting en laad ze in een injectieplaat. Gebruik een met vuur gepolijste pastour-pipet om de embryo's in de injectieplaat te plaatsen om de embryo's te immobiliseren.
Breek de punt van een injectienaald af en pas de injectie-instellingen aan om een injectiedruppel te maken met een volume van één nanoliter. Gebruik een dissectiescoop om een nanoliter MO in de yoke van ten minste 50 embryo's tussen de een- en viercellige stadia te injecteren. Voor DFC-gerichte M mo-injectie verzamel embryo's direct na de bevruchting en incubeer ze bij 28,5 graden Celsius.
Wanneer de embryo's het 256-celstadium bereiken, laad ze snel in een injectieplaat en injecteer een nanoliter fluorescerende MO in de yoke. Injecteer ten minste 100 embryo's tussen de 256 en 1000 celstadia om een yoke-gerichte injectie uit te voeren. Nadat bevruchte eieren tot de dome-fase zijn geïncubeerd, injecteer je een nanoliter fluorescerende MO in de yoke van ten minste 100 embryo's tussen de dome- en 30%are ply-stadia.
Wanneer M mo-geïnjecteerde embryo's het 75%a ply-stadium bereiken. Verwijder onbevruchte en dode embryo's onder een dissectiescoop voor globale MO-injecties. Kies levensvatbare embryo's voor gelijkmatig verdeelde fluorescentie in alle cellen.
Voor DFC-gerichte M mo-injecties, selecteer embryo's met fluorescentie verspreid door de yoke en geconcentreerd aan de dorsale geblazen dermmarge. Voor yoke-gerichte MO-injecties. Kies embryo's waarbij de fluorescentie gelijkmatig over de yoke is verdeeld en niet wordt waargenomen in enige embryonale cellen tussen de twee tot vier.
Selecteer DFC-gerichte embryo's die alleen fluorescentie vertonen in de KV-cellen en de yoke en gooi de rest weg voor yoke-gerichte injecties. Selecteer embryo's met exclusieve fluorescentie in de yoke om asymmetrische stroming in de KV van MO-geïnjecteerde embryo's te analyseren, begin door ongeveer 20 embryo's tussen de vier tot zes met scherpe pincetten zorgvuldig te coaten.
Transfereer één embryo naar een glazen depressieschuifje en verwijder zoveel mogelijk water. Immobiliseer het embryo door voldoende warme 1% lage smeltpunt aero toe te voegen om het net te bedekken terwijl de aero stolt. Gebruik pincetten om het zo te positioneren dat de KV omhoog wijst, monteer 10 embryo's en werk snel om ervoor te zorgen dat alle injecties zijn voltooid bij de 10.
Na het verdunnen van fluorescerende microkralen met een diameter van 0,5 micron tot één op 50 in steriel water. Meng de kralen grondig en laad drie microliters in een capillaire naald met behulp van dezelfde micro-injector die voor MO-injecties is gebruikt.
Gebruik pincetten om de naaldpunt te breken en pas de injectie-instellingen aan om de kleinst mogelijke injectiedruppel te genereren. Uitlijn vervolgens de naald onder een dissectiescoop met de KV-lumen van het eerste gemonteerde embryo. Steek vervolgens de naald in het lumen en injecteer minder dan 0,5 nanoliters kralen.
Voeg een druppel steriele water toe op de aros om te voorkomen dat het embryo uitdroogt onder een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop. Gebruik een 20 x objectief om de geïnjecteerde embryo's te screenen op succesvolle bezorging van kralen voor elk geselecteerd embryo met kralen binnen de KV bij een druppel steriele water om de aros te bedekken. Observeer vervolgens met behulp van een fluorescente compoundmicroscoop met een 63 x water-dipobjectief.
Gebruik een hogesnelheidscamera gemonteerd op de microscoop om een film van tien seconden op te nemen. Gebruik het fluorescente kanaal om de kralen op ongeveer 70 frames per seconde op te nemen en ofwel brightfield of differentiële interferentie contrast om het KV-lumen op te nemen. Importeer de films in Image J. Maak maximale projecties en gebruik de software om de bewegingen van de individuele kralen bij te houden.
Deze figuur toont de verdeling van fluorescerende MO in succesvolle stadiumspecifieke levend geïnjecteerde embryo's. Een onsuccesvolle MO-injectie waarbij de oplossing geaggregeerd blijft in de dooiercel wordt hier getoond. Vloeistofstroming in succesvol geïnjecteerde embryo's kan kwalitatief of kwantitatief worden gemeten in een controle-embryo met normale stromingskralen.
Volg tegen de klok in gerichte paden die kunnen worden gevisualiseerd door een maximale projectie van fluorescente kralenposities in de loop van de tijd te maken of door individuele kralen in de loop van de tijd te volgen. Om het verlies van gecoördineerde stroming te demonstreren, werden embryo's geïnjecteerd met MO om row kinase twee B of rock twee B te breken, wat de stroming verstoort, en als gevolg hiervan bewegen de kralen willekeurig in kv, de gemiddelde snelheid van vijf
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de modulatie van genfuncties in de vesikkel van Kupffer (KV) van zebravisembryo's, welke cruciaal is voor de links-rechts-patroonvorming. De auteurs beschrijven een methode om de vloeistofstroom in de KV te visualiseren door middel van het toedienen van fluorescerende kralen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Embriologie
Achtergrond
- Het vesikel van Kupffer speelt een belangrijke rol bij het vaststellen van de links-rechtsasymmetrie in zebravisjes.
- Cilia in het KV genereren een vloeistofstroom die de embryonale ontwikkeling beïnvloedt.
- Inzicht in de genfunctie in het KV kan aanwijzingen geven over ontwikkelingsprocessen.
- Fluorescerende kraaltjes kunnen worden gebruikt om vloeistofdynamica in het KV te visualiseren en te analyseren.
Doel van de studie
- Om de genfunctie specifiek te moduleren in KV-cellen van zebravissenembryo's.
- Om het effect van genmodulatie op de asymmetrische vloeistofstroom in de KV te analyseren.
- Om een techniek te ontwikkelen voor het visualiseren van de vloeistofstroom met behulp van fluorescente beads.
Gebruikte methoden
- Injectie van fluorescente morpholino-oligonucleotiden in de dooiercellen van embryo's in het midden-blastulastadium.
- Selectie van embryo's met fluorescente morpholino's in de KV voor verdere analyse.
- Injectie van fluorescente beads in het lumen van de KV.
- Videomicroscopie om de beweging van beads vast te leggen en de vloeistofstroom te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle modulatie van genexpressie in KV-cellen.
- Visualisatie van de vloeistofstroom in de KV met behulp van fluorescerende bolletjes.
- Kwantitatieve analyse van de bewegingen van de bolletjes om de impact van genfunctie op de vloeistofdynamica te beoordelen.
- De bevindingen suggereren dat specifieke gendepletie de asymmetrische vloeistofstroom in de KV verandert.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek maakt gerichte genmodulatie in KV-cellen mogelijk.
- Injectie van fluorescente kraaltjes is effectief voor het bestuderen van vloeistofdynamica in zebravissenbryo's.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de rol van de KV bij de links-rechts-patroonvorming.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Inzicht in de vestiging van links-rechts-asymmetrie in gewervelde embryo's biedt mechanistische inzichten in ontwikkelingssignaleringspaden die relevant zijn voor het modelleren van aangeborene afwijkingen. Het model van het vesicle van Kupffer bij de zebravis maakt visualisatie met een hoge resolutie van cilia-gestuurde vloeistofstroming mogelijk, wat bijdraagt aan doelwitvalidatie in de vroege ontwikkelingsbiologie. Deze benadering helpt bij het verminderen van risico's bij hypothesen over genen die asymmetrische signaleringscascades reguleren, voorafgaand aan translationele studies bij zoogdieren.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar genfuncties in dorsale voorlopercellen mogelijk om de impact op cilia-gemedieerde links-rechts-patroonvorming te beoordelen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van stadiumspecifieke morpholino-knockdown om chimerische embryo's te creëren voor lineage-beperkte functionele analyse.
- Voorspellende waarde: Verbindt gendepletie met veranderingen in asymmetrische vloeistofstroom, wat functionele read-outs biedt voor doelwitvalidatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: De injectie van fluorescente kraaltjes in het lumen van deblaasje van Kupffer maakt directe visualisatie en kwantificering van de door motiliteit aangedreven stroming mogelijk.
- Operationele waarde: Maakt hogesnelheidsvideo-opnamen en het volgen van kraaltjes mogelijk voor de objectieve meting van stromingsdynamiek.
- Assay-gereedheid: Genereert kwantitatieve verplaatsingsgegevens die kunnen worden gecorreleerd met genetische perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert de initiatie van de geconserveerde Nodal-signaleringsroute, relevant voor studies naar lateraaliteitsdefecten.
- Translationele continuïteit: Verbindt de ciliaire functie in de KV van zebravis met asymmetrische signalering in het laterale plaatmesoderm.
- Mechanische risicoreductie: Ondersteunt de evaluatie van het effect van kandidaatgenen op stroomsymmetrie voorafgaand aan testen in zoogdiermodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in discovery-workflows door genetische modulatie te koppelen aan functionele fenotypische read-outs in een levend embryo-systeem.
- Ontdekkingsbiologie: Test hypothesen over genfuncties in de organisatie en motiliteit van cilia via gerichte knockdown in dorsale voorlopercellen.
- Screening: Brengt fluorescente kraaltjes in om de stroming te kwantificeren als functionele output van cilia-activiteit.
- Analytica: Maakt gebruik van bead tracking om snelheids- en trajectgegevens te genereren voor de beoordeling van stroomasymmetrie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de KV-stroming met stroomafwaartse Nodal-signalering, wat de relevantie voor symmetrie-brekende mechanismen ondersteunt.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het koppelen van genfunctie aan fenotype bij de links-rechts patterning van vertebraten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in hoe genen de cilia-afhankelijke vloeistofstroom en de initiatie van symmetrie reguleren.
- Operationele waarde: Combineert lineage-specifieke gene knockdown met live imaging voor gecorreleerde genetische en fenotypische analyse.
- Strategische waarde: Maakt vroegtijdige go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van functionele verstoring van geconserveerde patroonvormingsmechanismen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de prioritering van targets op basis van hun rol bij het tot stand brengen van asymmetrische signaleringscascades.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van zebravisembryo's, micro-injectie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van de nauwkeurige timing van de injectie ten opzichte van de ontwikkelingsstadia (dome-stadium tot 30% epiboly voor targeting van de DFC).
- Vereist de preparatie van fluorescente kraaltjes en de mogelijkheid tot high-speed videocaptuur voor kwantificering van de stroming.
- Vereist optimalisatie van de kraaltjesconcentratie en het injectievolume om obstructie van het lumen of schade aan het embryo te voorkomen.
- Beperkt tot niet-zoogdiersystemen; bevindingen moeten worden gevalideerd in hogere vertebratenmodellen voor translationele relevantie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Stage-specific Injection of Morpholinos (MO)
3:10
Selecting Injected Embryos for Analysis
4:16
Mounting Embryos and Injection of Fluorescent Beads to Analyze Fluid Flow in Kupffer's Vesicle
5:56
Visualization and Analysis of KV Fluid Flow
6:38
Representative Kupffer's Vesicle Fluid Flow Results
7:45
Conclusion
