Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen

Het algemene doel van deze procedure is om adherante inflammatoire leukocyten te isoleren uit hersenbloedvaten van door plasmodium burge eye anca geïnfecteerde muizen om experimentele cerebrale malaria te induceren. Muizen worden geïnfecteerd met plasmodium berge eye anca geparasiteerde rode bloedcellen door injectie. Nadat de muizen tekenen van de ziekte beginnen te vertonen, worden de circulerende cellen van malaria geïnfecteerde muizen verwijderd door intraorale perfusie.

De hersenen worden vervolgens geoogst en het weefsel wordt met enzymen verteerd om de isolatie van inflammatoire leukocyten mogelijk te maken. Multikleurige flowcytometrie wordt vervolgens uitgevoerd om immunofenotypering uit te voeren. De analyse van de gesequestreerde leukocyten in de hersenen van de verkregen gegevens geeft het percentage en de absolute aantallen leukocyten weer die migreren naar de hersenen van muizen met malaria.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van malaria pathogenese te beantwoorden, zoals welk type inflammatoire cellen migreren naar de plaats van parasietsequestrati in de hersenen van geïnfecteerde dieren onder verschillende experimentele omstandigheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. De perfusiestappen zijn moeilijk te leren omdat ze zowel snelheid als zorg vereisen om geen significante bloedvaten te beschadigen. Het demonstreren van sommige delen van deze procedure zal worden gedaan door Leanna Mcic, een dierentechnicus, Ms. Victoria, Rick, een promovendus, en Dr. Lisa Aez, een postdoc uit mijn laboratorium.

Begin dit protocol door de muizen te infecteren met p berge eye anca. Ontdooi een gecryopreserveerde aliquot van P berge eye anca geparasiteerde rode bloedcellen of pbcs door het op kamertemperatuur te laten komen. Verwijder een acht tot 12 weken oude donormuis uit zijn kooi en plaats deze op een werkstation. Pak de scruff van de nek tussen de wijsvinger en de duim.

Draai de muis om en injecteer 100 tot 200 microliters van plasmodium berge eye in de buikholte. Gewoonlijk worden twee donormuizen geïnjecteerd met pbcs. Na het injecteren, plaats de muizen in hun kooi vier tot vijf dagen na de infectie.

Verwijder een donormuis uit zijn kooi en plaats deze op een werkstation. Plaats een druppel bloed van de staartader van de muis in de buurt van het einde van een bevroren eind microscoopglas. Plaats een tweede glas op een hoek van 45 graden en steek het in de druppel bloed.

Zodra het bloed zich langs de rand verspreidt, duwt u de spreider gelijkmatig over het microscoopglas om de bloeduitstrijk te maken. Laat de uitstrijk drogen om de bloeduitstrijk te fixeren. Dompel de glazen in 100% methanol gedurende 30 seconden.

Vervolgens kleurt u de glazen in vers bereidde GIM ZA gedurende 10 minuten. Na het kleuren met gim za, spoelt u het glas met stromend water gedurende 30 seconden. Laat het glas drogen en onderzoek het vervolgens onder de microscoop met behulp van de 100 x olie-immersielens. Tel de PRBC binnen duizend erytrocyten en bereken het procent para als de donormuis de vereiste niveaus van 2,5 tot 5% Parsit heeft bereikt. Verzamel bloed van de donormuis door cardiale punctie onder anesthesie of retroorbitale bloeding met behulp van een heparine-gecoate micro hematocriet capillair buis.

Los het bloed op in RPMI medium met een eindconcentratie van een keer 10 tot zes PRBC per 0,2 milliliter per muis. Overweeg dat een normale muis hematocriet ongeveer zes keer 10 tot de negende rode bloedcellen per milliliter is. In feite, acht tot 12 weken oude experimentele C 57 zwarte zes muizen door één keer 10 tot de zesde PRBC in 0,2 milliliter intraperitoneaal te injecteren zoals eerder.

Om de para niveaus van geïnfecteerde muizen te monitoren, bereid een bloeduitstrijk zoals eerder. Para moet worden bepaald elke twee tot drie dagen, beginnend op dag twee of drie na infectie vanaf dag vijf. Na infectie.

Muizen worden dagelijks gemonitord op tekenen van ernstige malaria zodra de para niveaus groter zijn dan 5% en muizen neurologische symptomen vertonen rond dag zes na infectie. De geïnfecteerde muizen worden geëuthanaseerd door CO2 inademing en onmiddellijk geperfundeerd met PBS zoals beschreven in het bijbehorende document. Het moeilijkste aspect van deze procedure is de intracardiale perfusie.

Een reeks tips voor probleemoplossing zijn hier geschetst. Met de muis vastgemaakt op een styrofoam dissectiebord. Binnen een dissectielade. Veeg de ventrale kant af met 70% ethanol en gebruik vervolgens grote schaar en pincet om de huid langs de middenlijn open te snijden om de borstholte bloot te leggen, vouw en speldt de huid aan de zijden vast.

Houd het borstbeen vast met fijne pincet en snijd het diafragma en langs beide zijden van het borstbeen door, waardoor de ribben worden afgesneden. Zorg ervoor dat u geen grote bloedvaten beschadigt. Speld de ribbenkast vast door het borstbeen losjes naast het hoofd.

Houd de ventrikels vast met fijne pincet en snij voorzichtig de rechter atrium in met fijne schaar. Voeg een 23 gauge naald toe die is bevestigd aan het zwaartekrachtperfusiesysteem in de linker ventrikel richting de opgaande aorta. Terwijl PBS stroomt, steekt u slechts 0,5 centimeter van de naaldpunt in en perfundeert u de muis gedurende vijf minuten of totdat de effluent helder is.

Na de interale perfusie, dissecteer de hersenen en plaats deze in een 10 milliliter centrifugebuis met RPMI.Medium. Plaats de vers geoogste hersenen bovenop een 40 tot 60 maasgrootte roestvrijstalen celfilter in een petrischaal met drie tot vijf milliliter RPMI weefselkweekmedium. Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes.

Gebruik vervolgens een kristalplunger om kleine stukjes hersenweefsel door het celfilter te duwen. Breng het hersenhomogenaat over in een 10 milliliter buis en centrifugeer deze gedurende 10 minuten bij 250 keer G bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren de supernatant weg en los het pellet op in drie milliliter RPMI