Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in Drosophila Larven

Het algemene doel van het volgende experiment is om het aangeboren en circadiane fotogedrag van drosophila-larven te testen door middel van een lichtdonkervoorkeurstest. Dit wordt bereikt door de experimentele larven eerst te kweken onder gedefinieerde lichtdonkercondities om een initiële circadiane klok in de larven te vestigen. Vervolgens worden de larven overgebracht naar constante duisternis, waardoor de circadiane klok van de larven vrij kan lopen.

Eens op het L drie voedingsstadium, worden de lava in groepen gesorteerd om hun lichtvoorkeur op verschillende circadiane tijdstippen te testen. Resultaten worden verkregen die aangeboren en circadiane lichtvoorkeur laten zien door een voorkeurindex te berekenen en te vergelijken tussen tijdstippen en experimentele groepen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de aangeboren en circadiane regulatie van lichtdetectie en de verwerking van fotogedrag, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals olfactie, smaak, chemisch en thermische taxine.

Het kan ook worden aangepast voor leer- en geheugentests. De procedure zal worden gedemonstreerd door Alina en BMA To afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium To eieren te verzamelen, volwassen vliegen toe te staan om gedurende 12 uur op verse bestanden te leggen en ze over te brengen naar nieuwe flesjes. Blijf de volwassenen elke 12 uur overbrengen voor een 12-uurs licht, 12-uurs donkercyclus.

Bewaar de 12-uurs eierverzamelingen in de incubator. Voor het experiment, breng de dieren op het vroege L drie larvenstadium groot. Dit zijn voedende lae beschikbaar 84 tot 108 uur vanaf het ei.

Correct tijdstip van LAE leggen is cruciaal voor het succes van het experiment. Sinds late L drie, veranderde LAE het fotogedrag To test op circadiane componenten van visueel gedrag. 48 uur voor de test en net voordat de larven subjectief zijn, dag, zet de verzamelde larven in een kartonnen doos.

Breng vervolgens de doos over naar een incubator met constante duisternis voor 48 uur tot aan het experiment, deze larven moeten ongestoord in hun toegewezen ruimte blijven. Bereid het deksel van een negen centimeter Petri-schaal voor met een vierkant van 20 centimeter dat in vier kwadranten is verdeeld. Als gids.

Lijm 10 centimeter vierkanten aluminiumfolie op tegenoverliggende kwadranten en bedek ze met zwart plakband. Zorg ervoor dat de rand van het deksel wordt bedekt. Lijm vervolgens een 20 centimeter vierkant dat in vier kwadranten is verdeeld onder de lichtbron op de tafel.

Markeer de omtrek van een testbak op het blad om als gids te dienen voor consistente verplaatsing. Installeer een LED-lamp boven de Petri-schaal met behulp van een ijzeren steunstatief. Pas de hoogte zo aan dat de hele testplaat homogeen wordt verlicht.

Stel de lichtintensiteit op een testlocatie in op tussen de 350 en 760 luxe door de lamphoogte verder aan te passen of door een instelbare voeding te gebruiken. De experimentenkamer heeft rode lichtverlichting nodig en moet dezelfde temperatuur hebben als waar de dieren zijn grootgebracht. De flesjes worden twee dagen onder constante duisternis grootgebracht.

Verzamel de lava in hun voedsel met een spatel vanaf de bovenste vijf millimeter van het voedsel. Verspreid het voedsel op de buitenkant van een petrischaaldeksel. Voeg wat water toe aan het voedsel en meng het voorzichtig met de spatel.

Voeg een druppel kraanwater toe aan een nieuwe schaal met behulp van een penseel. Breng de larven over naar de druppel water om ze te wassen. Gebruik vervolgens een nat penseel om de larven te verzamelen met behulp van het natte penseel.

Selecteer alleen de vroege voedende L drie larven en vermijd late rondzwervende L drie larven. Breng de geselecteerde larven over naar het centrum van een testplaat. Voedende L drie larven hebben anterieure bolvormige structuren die open en naar buiten steken.

In een vingervormige vorm. De achterste bolvormige structuren hebben elk drie openingen en vier groepen grote vertakte haren. De speekselklieren reiken tot het tweede buiksegment.

Zodra 30 larven op het centrum van de testplaat zijn geplaatst, bedek deze met het voorbereide deksel. Zet de LED-lamp aan. Start een timer en laat de larven vijf minuten vrij op de plaat bewegen.

Verwijder vervolgens snel het deksel en tel het aantal larven in de donkere en in de lichte kwadranten. Het markeren van de positie van elke lava kan het tellen vergemakkelijken. Een snelle foto kan ook helpen. Larven die een onduidelijke lichtvoorkeur vertonen, zoals larven die op de muren kruipen of zich in agar boren, moeten als neutrale voorkeur worden geteld en worden toegevoegd aan het totale aantal larven wanneer de lichtvoorkeurindex wordt berekend.

Na het tellen van de larven, gooi de plaat weg en gebruik een nieuwe testplaat voor het volgende experiment. Na het uitvoeren van 10 tot 15 proeven per genotype, gaat u verder met de analyse volgens het protocol. De lichtdonkervoorkeur van Canton ES lava werd vergeleken op twee verschillende circadiane tijdstippen.

CT nul en CT 12, subjectief, dageraad en schemering larven of kreunen gedurende 48 uur onder standaard omstandigheden en schakel vervolgens over naar constante duisternis gedurende drie dagen. Lichtdonkertest onder 350 luxe onthulde dat lichtfotogevoeligheid hoger was bij larven getest bij CT nul in vergelijking met larven getest bij CT 12. Met behulp van deze formule was de duisternisvoorkeur van CT nul lava 0,52 vergeleken met 0,36.

De CT 12 larven vergelijken de indexen met behulp van een wilcoxon-test produceert significante P-waarde van 0,023. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de lichtvoorkeur van troph-larven op verschillende circuit- en tijdstippen kunt testen om dit doel te bereiken. U zou in staat moeten zijn om op stadium F drie oph-larven te trainen, hun fotofobe gedrag te testen en de lichtvoorkeurindex te berekenen voor statistische vergelijking.