Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van 19 F / 1 H Magnetic Resonance Imaging
20 maart 2013
Het volgen van cellen met behulp van MRI heeft opgedaan opmerkelijke aandacht in de afgelopen jaren. Dit protocol beschrijft de etikettering van dendritische cellen met fluor ( 19 F)-rijke deeltjes, de in vivo toepassing van deze cellen, en het toezicht op de omvang van hun migratie naar de drainerende lymfeklier met 19 F / 1 H MRI en 19 F MRS.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van dendritische cellen naar de afvoerende lymfklier te visualiseren met behulp van niet-invasieve fluor-magnetische resonantiebeeldvorming of MRI in combinatie met conventionele proton-MRI. Dit wordt bereikt door eerst murine beenmerg afgeleide dendritische cellen te bereiden en de volledig gedifferentieerde cellen te labelen met fluor-rijke deeltjes. Tijdens de tweede stap worden de fluor-gelabelde cellen intracutaan toegediend in de achterpoten van een muis, waardoor een efficiënte transmigratie van de toegediende cellen wordt gewaarborgd.
Vervolgens wordt het anatomische gebied van belang gevisualiseerd door middel van fluor-, proton-MRI, om de migratie van de dendritische cellen van de huid naar de afvoerende lymfeklieren te volgen. Uiteindelijk kan de migratie van dendritische cellen vanuit het toedieningsgebied naar de afvoerende lymfklier worden gevisualiseerd door fluor-MRI. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van andere celtrackingtechnieken, zoals die welke ijzeroxide nanodeeltjes vereisen, is dat koolstofgebonden vloeren vrijwel afwezig zijn in alle levende organismen.
Dit levert volledige achtergrondvrije beelden en een complete selectiviteit van cellen op na toediening van fluor-gelabelde cellen in vivo. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van immunologie, zoals wat de invloed is van moleculaire kandidaten op de migratie van dendritische cellen in vivo. De methode wordt gedemonstreerd door Yulia Kovski, een technicus en Helma VIIs, een senior wetenschapper uit mijn laboratorium op dag 10 van de beenmerg dendritische celcultuur.
Activeer de dendritische cellen met LPS gedurende 24 uur. Label de dendritische cellen met één millimolair fluor-rijk per fluoro 15 kroon vijf ether deeltjes gedurende deze tijd, om te bevestigen dat de dendritische cellen succesvol zijn gelabeld, controleer de fysisch-chemische eigenschappen van de cellen met behulp van flowcytometrie. De fluor-gelabelde cellen worden hier weergegeven als rode gebeurtenissen op de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsgrafiek en de ongelabelde cellen worden weergegeven als blauwe gebeurtenissen.
Positioneer vervolgens een C 57 zwarte zes muis in een houder en laad vervolgens een 0,5 milliliter tuberculine-spuit met een 26 en een halve gauge naald met fluorescent gelabelde dendritische cellen in een volume van 50 tot 100 microliter. Steek nu voorzichtig de naald in de bovenste huidlagen van elk van de achterpoten van het dier om de cellen toe te dienen. Nadat het muisje is verdoofd, plaats het dier op de muisbed van de kleine dier MR Scanner.
Nadat het dier is bevestigd op de beeldvormingshouders en de verbindingen met het bewakingssysteem, verplaats de houder naar het centrum van de proton fluor RF-spoel voor het bevestigen van de juiste positionering van het dier en de scanner. En later plannen van de beeldslice geometrie. Verwerf verkennerbeelden in drie standaardoriëntaties met behulp van snelle en lagere resolutie beeldverwervingsmethoden in de MR Scanner software.
Stel de RF-spoel af op de proton resonantiefrequentie en op de fluor resonantiefrequentie. Gebruik de afstemmonitor van de dier MR Scanner om de karakteristieke impedantie van de spoel af te stemmen op 50 ohm. Stel vervolgens de noodzakelijke automatische systeeminstellingen in, inclusief shimming om de homogeniteit van het magnetische veldsysteem te verfijnen, frequentieaanpassingen om de RF af te stemmen op de specifieke LA-frequentie van het MR-systeem voor protonen en referentie-versterking.
Om de RF-amplitude aan te passen, stel een turbo rare 3D-protocol in voor de protonscan, met een TR van 1500 milliseconden en een TE van 53 milliseconden, een matrix van 400 bij 200 bij 200 en een rare factor van 16. Pas het veld van zicht aan met behulp van de verkennerbeelden. Start vervolgens de scan.
Laad een enkele puls FID-sequentie met de TR van minimaal 1000 milliseconden, en open vervolgens de scanbewerking en stel de kern in op fluor in de bewerkingsmethode van de toolbox. Schakel de automatische referentie-versterking uit met behulp van de opdrachten. Start de meting zonder de gegevens op te nemen om een MR-signaal in realtime weer te geven.
Stel de basisfrequentie in om de fluor spectrale piek op nul hertz in het verwervingsvenster te centreren. Selecteer vervolgens, pas de basisfrequentie toe en druk op nu stoppen. Kloon het turbo rare 3D-protocol van de vorige protonscan.
Ga naar bewerkingsmethode en schakel vervolgens de automatische referentie-versterking uit zoals zojuist getoond in scanbewerking. Stel de fluor-kern in en verander vervolgens de matrix naar 1 28 bij 64 bij 64 en de rare factor naar minimaal 40. Wanneer de scans zijn voltooid, trek de muishouder uit de MR-scanner en gebruik het menu weergave om de fluor-beelden te overlappen met proton-beelden.
Na het opofferen van de muis, verwijder de popal lymfklier van belang en plaats deze in een vijf millimeter NMR-buis met 100 microliter 2%PFA. Plaats vervolgens de buis in een fluor spectroscopie spoel en beweeg de spoel naar het ISO-centrum van de magneet. Stem de RF-spoel af op de fluor resonantiefrequentie en pas vervolgens de karakteristieke impedantie van de spoel aan op 50 ohm binnen de shimming toolbox op de dier MR Scanner.
Stel alle shimparameters op nul en druk op toepassen. Laad vervolgens een enkele puls FID-sequentie met een TR van minimaal 1000 milliseconden. Open scanbewerking en stel de kern in op fluor.
Gebruik nu opdrachten, start de sequentie, pas de basisfrequentie aan zodat de fluor spectrale piek zich in het midden van het verwervingsvenster op nul hertz bevindt en pas de basisfrequentie toe. Pas vervolgens de pulsdemper opnieuw aan om het signaal te maximaliseren om een excitatie van 90 graden te bereiken. Wanneer het signaal het maximum bereikt, drukt u op stoppen.
Stel tenslotte in bewerkingsmethode de gemiddelden in tussen 64 en 256 afhankelijk van het signaal, en start vervolgens de verwerving 18 tot 21 uur na intracutane toediening. Fluor-gelabelde dendritische cellen migreren naar de afvoer
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het volgen van de migratie van dendritische cellen met behulp van niet-invasieve fluor-MRI in combinatie met protonen-MRI. Het proces omvat het labelen van dendritische cellen uit murine beenmerg met fluorrijke deeltjes en het monitoren van hun beweging naar de drainerende lymfeklieren.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Beeldvormingstechnieken
- Celtracking
Achtergrond
- Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Het volgen van celmigratie is essentieel voor het begrijpen van immuunfuncties.
- Traditionele trackingmethoden kunnen beperkingen hebben.
- Fluor-MRI biedt een niet-invasief alternatief voor het monitoren van celbeweging.
Doel van de studie
- Om de migratie van dendritische cellen naar lymfeklieren te visualiseren.
- Om fluor-MRI te gebruiken voor het volgen van gelabelde cellen.
- Om de effectiviteit van deze methode te vergelijken met traditionele technieken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van dendritische cellen afgeleid van muizenbeenmerg.
- Labeling van cellen met fluorrijke deeltjes.
- Toediening van gelabelde cellen in de achterpoten van muizen.
- Beeldvorming van de celmigratie met behulp van fluor- en proton-MRI.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de migratie van dendritische cellen naar lymfeklieren.
- De effectiviteit van fluor-MRI bij het volgen van cellen is aangetoond.
- De voordelen ten opzichte van traditionele methoden met ijzeroxide-nanodeeltjes zijn belicht.
- Inzichten verschaft in de dynamiek van de beweging van immuuncellen.
Conclusies
- Fluor MRI is een krachtig instrument voor niet-invasieve celtracking.
- Deze methode verbetert het begrip van immuunresponsen.
- Verder onderzoek zou de toepassingen binnen de immunologie kunnen uitbreiden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Niet-invasieve tracking van de migratie van immuuncellen met behulp van fluor-MRI biedt een achtergrondvrije, kwantitatieve methode om de trafficking van dendritische cellen in vivo te evalueren. Deze mogelijkheid ondersteunt het mechanistische de-risking bij de ontwikkeling van immunotherapie door directe visualisatie van cellulaire responsen op moleculaire kandidaten mogelijk te maken. De techniek verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door farmacologische interventies te koppelen aan functionele immuunuitkomsten in ziekte-relevante systemen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen over migratiepaden van dendritische cellen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Biedt achtergrondvrije beeldvorming voor eenduidige detectie van gelabelde cellen in vivo.
- Voorspellende waarde: Kwantificeert celtransport naar lymfeklieren, wat bijdraagt aan functionele targetvalidatie en portfolio-triage.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gevalideerde, met fluor gelabelde cellsystemen voor downstream imaging-toepassingen.
- Operationele waarde: Standardiseert protocollen voor cellabeling en detectie voor reproduceerbare signaalkwantificering.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform in immunologie- en oncologiemodellen die read-outs van celtransport vereisen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt ziekte-relevante tracking van dendritische cellen mogelijk in modellen voor auto-immuunziekten en kankertherapie.
- Operationele waarde: Faciliteert longitudinale monitoring van celmigratie van weefsel naar lymfoïde organen.
- Translationele continuïteit: Verbindt imaging in de ontdekkingsfase met preklinische validatie van immunomodulerende kandidaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is te integreren in discovery biology-workflows door het leveren van kwantitatieve, niet-invasieve read-outs van de migratie van dendritische cellen, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-compounds en besluitvorming bij preklinische verdere ontwikkeling.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van moleculaire kandidaten die de trafficking van dendritische cellen in vivo beïnvloeden.
- Screening: Levert assay-klare, met fluor gelabelde cellen met gestandaardiseerde detectie via 19F MRI en MRS.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van celmigratie mogelijk door kwantificering van het fluorsignaal aan de hand van kalibratiecurven.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de ontwikkeling van biomarkers door de beweging van immuuncellen in ziektemodellen te volgen.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbaar imagingplatform voor het volgen van diverse celtypen in de immunologie en oncologie.
Operationele & zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar immuuncelmigratie door selectieve detectie zonder achtergrondruis.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en standaardisatie tussen laboratoria via gestandaardiseerde labelings- en imagingprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door targetmodulatie te koppelen aan functionele uitkomsten van immuunceltransport.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van kwantitatieve gegevens over de migratie van dendritische cellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, labeling met fluorrijke deeltjes en het bedienen van MRI-systemen voor kleine dieren.
- Toegang tot dual-tuned 1H/19F RF-spoelen en MRI-systemen die geschikt zijn voor spectroscopische acquisitie is noodzakelijk.
- Stelt standaardisatie van de labeling-efficiëntie van cellen en de timing van de beeldvorming tussen experimentele groepen vereist.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen voor verschillende celtypen en weefseldiepten die de signaaldetectie beïnvloeden.
- Beperkt door de noodzaak van ex vivo validatie via extractie van lymfeklieren en MRS voor absolute kwantificatie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:46
Labeling and In vivo Application of Dendritic Cells (DC) with 19F (Fluorine)-rich Particles
2:47
In vivo 19F/1H (Proton) Magnetic Resonance Imaging (MRI)
5:04
Lymph Node Magnetic Resonance Spectroscopy (MRS)
6:20
Results: Quantification of 19F-labeled DC Migration In vivo using 19F MRS
7:33
Conclusion
