Peptide-gebaseerde identificatie van functionele Motieven en hun bindingspartners

Deze video presenteert een reeks van vier experimenten die worden gebruikt voor het identificeren van functionele HIV-1 NPH-eiwitmotieven en voor het ontwikkelen van op peptiden gebaseerde remmers. Specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in volledige eiwitten, behouden zowel hun biologische functie als remmen competitief de functie van het volledige eiwit om apoptotische motieven te identificeren. In HIV-1 NEF jerk cat-cellen worden blootgesteld aan NEF-scanpeptiden en een tunnel apoptose-assay wordt uitgevoerd om peptiden te identificeren die apoptose induceren.

Een tweede set peptiden met variaties op een NEF-secretiemotief. De secretiemodificatieregio of SMR wordt samen met NPH GFP-verlies van functie door competitieve remming getransfecteerd in cellen, aangegeven door verminderde secretie van nph. GFP wordt beoordeeld door fluorometrie om cellulaire factoren te identificeren die interageren met de secretiemodificatieregio of SMR van nef.

Coun-precipitaties worden uitgevoerd met behulp van SMR wild-type NPH als lokaas. Ten slotte, om te testen of deze interacties de secretie beïnvloeden, worden antilichamen tegen geïdentificeerde bindingspartners getransfecteerd in cellen. Om te beoordelen of ze de NF-motiefsecretie antagonizeren, identificeren de verkregen resultaten twee functionele apoptotische motieven in NEF en een remmerpeptide dat een functioneel NEF-secretiemotief antagonizeert, evenals de cellulaire bindingspartners die voor secretie vereist zijn.

Het algemene doel van deze reeks van vier experimenten is om de identificatie van functionele motieven in doeleiwitten te versnellen en vervolgens die gegevens te gebruiken om peptide-basisremmers van deze functionele motieven te ontwikkelen. Deze set protocollen is nuttig geweest voor onze groep om ons te helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot HIV-pathogenese, zoals het begrijpen van de rol van nef-aangedreven secretie in pathogenese en het ontcijferen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan nef's vermogen om de exosomale transportroute te manipuleren. Vandaag zal Dr. Ming Bo Huang, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium, de procedures demonstreren.

Begin deze procedure met een reeks peptiden die het gebied van belang voor dit experiment scannen. 20 mer-peptiden met een overlap van 10 aminozuren die het volledige HIV-1 NPH-eiwit beslaan, werden verkregen van het AIDS-reagensprogramma. Om NPH-apoptosemotieven te identificeren, voert u een apoptose-assay uit met behulp van de NEF-scanpeptiden afzonderlijk als volgt: voeg een milliliter kweekmedium toe met 10 nanogram per milliliter peptide per 35 millimeter bord van jerk hat-celculturen en incubeer de culturen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Na de incubatie voert u een terminaal desoxynucleotidyltransferase-gemedieerde DUTP, biotin-nick en labeling- of tunnel-assay uit om apoptose te beoordelen. Om dit te doen, wast u eerst de cellen met PBS, aspireert u de PBS en voegt u 4% Paraformaldehyde in PBS toe, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Na het fixeren van de cellen, wast u ze met PBS en voegt u Triton X 100 toe, incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om ze te permeabiliseren. Na het fixeren en permeabiliseren van de cellen, voegt u tunnelreagens toe en incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 graden Celsius na permeabilisering.

Spoel de cellen twee keer met PBS. Bepaal vervolgens het percentage gekleurde cellen door epifluorescentie op een computergestuurd microscoopsysteem. Na transfectie van jca-cellen met NPH, GFP-plasmide en verschillende variaties van het SMR-peptide met behulp van chariot-eiwitbezorgingsreagenskit zoals beschreven in het bijbehorende document, verzamelt u het medium om de transfectie-efficiëntie te bepalen door middel van fluorescentiemicroscopie.

Maak fluorescente en lichtveldbeelden en bepaal het percentage cellen. Vervolgens om de remming van NPH GFP-secretie te beoordelen, brengt u 100 microliter van het celvrije geconditioneerde medium over naar afzonderlijke putjes van een 96-putjes zwarte microtiterplaat. Gebruik een fluorimeter met excitatiegolflengte 485 nanometer en emissiegolflengte 515 nanometer om de GFP-fluorescentie in het medium te meten in relatieve fluorescentie-eenheden.

Nadat de meting is voltooid, brengt u de gegevens over naar een pc. Stel het niveau van GFP-fluorescentie in het controlemedium op 100% in. Vergelijk dit vervolgens met het niveau van GFP-fluorescentie in het medium van cellen die co-getransfecteerd zijn met verschillende SMR-peptiden om veranderingen in NPH GFP-secretie te bepalen. De co-IP voor het isoleren van motiefbindingspartners is een moeilijke stap.

Zorg ervoor dat de kralen goed worden geschud tijdens de incubaties en dat zoveel mogelijk vloeistof wordt verwijderd uit de kralen tijdens elke wasstap. Laat jerk hat-cellen groeien in RPMI 1640-medium met 10%FBS bij 37 graden Celsius in een T 75 weefselkweekkolf, bepaal de celpelleti door centrifugatie bij 1000 keer G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer het cellenpellet in één milliliter PBS en breng het over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 keer G. Resuspendeer vervolgens het pellet in één milliliter Anti-Flag-lyseringsbuffer door voorzichtig pipetten en differentieel microcentrifugeren.

De suspensies bij 2000 keer G gedurende vijf minuten en bij 13.000 keer G gedurende 10 minuten. Om het cellulaire debris en DNA te pelleten, verzamelt u het supernatant, hierna lysaat genoemd. Na bepaling van de eiwitconcentratie, voegt u één milligram lysate-eiwit en één microgram van de SMR wild-type of SMR-mutante peptide toe aan 20 microliters van Anti-Flag M two affiniteitsgel.

Dit affiniteitsgel wordt hierna het hars genoemd. Breng het mengsel op een eindvolume van één milliliter in co-IP-buffer. Bereid ook een negatieve controle voor waarin het lysaat wordt gecombineerd met hars in afwezigheid van een van beide peptiden. Incubeer de mengsels gedurende één nacht bij vier graden Celsius met eind-over-einde rotatie.