Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer
13 juni 2013
Trypsine digest is een van de meest gebruikte methoden voor retinale vasculatuur analyseren. Dit manuscript beschrijft de methode in detail, met inbegrip van belangrijke wijzigingen aan de techniek te optimaliseren en te verwijderen van de niet-vaatweefsel met behoud van de algehele architectuur van de schepen.
Het algemene doel van deze procedure is om het vasculaire netwerk van het netvlies te isoleren. Dit wordt bereikt door eerst een reeks waterwassingen uit te voeren op het geïsoleerde netvlies. In de tweede stap wordt het netvlies gedurende ongeveer één tot anderhalf uur in trypsine gedigesteerd bij 37 graden Celsius, afhankelijk van de grootte van het netvlies.
Vervolgens wordt het vaatstelsel geïsoleerd door middel van aanvullende waterwassingen en dissectie onder een microscoop. Uiteindelijk kunnen pathologische vasculaire veranderingen zoals micro-aneurysma's, capillaire degeneratie en abnormale verhouding tussen endotheelcellen en parasieten worden gevisualiseerd. Het belangrijkste voordeel van try and digest ten opzichte van bestaande methoden zoals het bereiden van retinale flatmounts is dat het hele vasculaire netwerk met grote duidelijkheid kan worden gemarkeerd.
Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat deze technisch uitdagend en moeilijk consequent uit te voeren is. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor vaatisolatie moeilijk te leren zijn door alleen woorden. Dit is een zeer waardevol hulpmiddel in elk laboratorium dat retinale vasculaire biologiestudies uitvoert, zoals bij sommige ziekten zoals diabetische retinopathie. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Jonathan Chow, een getalenteerde medische student uit mijn laboratorium.
Na het fixeren van het geënuleeerde muizenoog en 10% neutraal gebufferd formine gedurende 24 uur, plaatst u het oog in een petrischaal en bedekt het met een kleine hoeveelheid water. Begin de dissectie door een paar dissectiescharen te gebruiken om voorzichtig een eerste snede in het hoornvlies te maken. Houd vervolgens het gesneden gebied vast met rechte pincetten en gebruik een schaar om langs de rand van het hoornvlies en de sclera te snijden en het hoornvlies te verwijderen.
Gebruik vervolgens fijne, gebogen en rechte pincetten. Om voorzichtig de sclera en choroïde van het netvlies weg te pellen richting oogzenuw. Verwijder vervolgens de lens en eventueel overtollig iris en puin van het netvlies om de neurale netvlieslagen te scheiden van de bloedvaten.
Neem ongeveer 500 microliter 45 micrometer gefilterd water op een 24-wellplaat en plaats het netvlies in een putje en schud gedurende vier tot vijf uur op kamertemperatuur, waarbij het water om de 30 tot 60 minuten wordt ververst. Blijf het netvlies in water wassen met zacht schudden gedurende de nacht. Verwijder de volgende dag bij kamertemperatuur het water en controleer onder een microscoop bij 3% trypsine om er zeker van te zijn dat er geen puin in de putje wordt aangetroffen. Om te voorkomen dat het vaatstelsel eraan hecht, incubeer het weefsel vervolgens gedurende één tot anderhalf uur bij 37 graden Celsius met zacht of geen schudden.
Wanneer het weefsel tekenen van ontbinding begint te vertonen, plaats de plaat op het microscooptafel en vermijd vervolgens het netvlies. Verwijder voorzichtig het trypsine om het vaatstelsel te scheiden. Voeg eerst gefilterd water toe aan het netvlies met behulp van pincetten.
Pel de interne begrenzingsmembraan af, die zichtbaar is als een dunne, transparante laag. Schud de plaat lichtjes. Plaats de plaat na vijf minuten weer op het microscooptafel en vervang voorzichtig het water, waarbij schade aan het netvlies wordt vermeden om het vaatnetwerk te bevrijden van het aanhechtende retinale weefsel.
Was het netvlies zoals zojuist is gedemonstreerd tot er weinig tot geen puin meer in het water achterblijft na de laatste wasbeurt. Het verwijderen van al het non-vasculaire weefsel is typisch het lastigste deel van de procedure. De volgende technieken kunnen achtereenvolgens of afzonderlijk worden gebruikt. Om de isolatie van het vasculaire netwerk te vergemakkelijken, is een belangrijk tip om alle gereedschappen en trypsine te dopen voordat het netvlies wordt gemanipuleerd.
Dit kan helpen voorkomen dat weefsel aan het apparaat hecht. Bekleed een 200 microliter micropipettip met gereserveerde trypsine en pipet vervolgens voorzichtig water op en neer, naast en naar de retinale vaten, wat zachtjes roeren veroorzaakt. Als het non-vasculaire weefsel nog steeds resistent is, plaatst u een trypsine-gecoate micropipettip bij de oogzenuw en pipet het hele vaatnetwerk op en neer om het non-vasculaire weefsel te helpen breken.
Ten slotte kunnen fijne pincetten worden gebruikt om het vaatstelsel voorzichtig uit het water te tillen om eventuele aanhechtende non-vasculaire componenten los te maken. Het eindresultaat zou een intact, puin-vrij vasculair netwerk van het netvlies moeten zijn.
Om het vaatstelsel te visualiseren, plaatst u eerst een druppel water op een schone dia. Breng vervolgens de gedigesteerde vaten over in het water onder een microscoopcontrole. Als de VAs-flapmount is gevouwen of ontvouwd, leiden gevouwen vaten tot slechte zichtbaarheid.
Wanneer gekleurd, als het weefsel is gevouwen, voegt u extra water toe en schudt u voorzichtig de dia om het ontvouwen te vergemakkelijken. Gebruik vervolgens een micropipet om langzaam overtollig water te verwijderen. Het eindproduct van een succesvolle procedure is een flatmount van het hele netwerk van het muizenretinale vaatstelsel met behoud van de architectuur en gekleurd met hemat, toin en eoin.
Zoals hier getoond, zoals te zien is in deze afbeelding, kan een duidelijke differentiatie tussen de endotheelcellen en de pericyten in het netvlies worden waargenomen. De kernen van de endotheelcellen, zoals aangegeven door de witte pijl, zijn ovaal of langwerpig en liggen volledig binnen de vaatwand. De parasietkernen, aangegeven door de zwarte pijl, zijn klein, rond, kleuren dicht en hebben over het algemeen een prominente positie langs de capillaire wand.
Trypsine en digest is een veelgebruikte procedure om vasculaire pathologie te analyseren in diabetische diermodellen. Deze afbeelding toont een voorbeeld van capillaire degeneratie zoals aangegeven door de wit
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft de trypsine-digestiemethode voor het analyseren van de retinale vasculatuur, met de nadruk op belangrijke optimalisaties om de techniek te verbeteren. Het proces isoleert effectief het vasculaire netwerk terwijl de architectuur van de vaten behouden blijft.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Retinale biologie
- Vasculaire analyse
Achtergrond
- Analyse van de retinale vasculatuur is essentieel voor het begrijpen van diverse pathologieën.
- Traditionele methoden bieden mogelijk geen duidelijke visualisatie van het volledige vasculaire netwerk.
- Trypsine-digestie biedt een verfijnde benadering om retinale vaten te isoleren en te visualiseren.
- Deze methode maakt het mogelijk om pathologische veranderingen in de vasculatuur te onderzoeken.
Doel van de studie
- Om de trypsinestdigestiemethode in detail te beschrijven.
- Om de techniek te optimaliseren voor een betere helderheid bij vasculaire visualisatie.
- Om de voordelen van deze methode ten opzichte van bestaande technieken aan te tonen.
Gebruikte methoden
- De geïsoleerde retina ondergaat een reeks wasstappen met water.
- Vertering in trypsine bij 37 °C gedurende 1-1,5 uur.
- Isolatie van het vaatstelsel door middel van aanvullende wasstappen en dissectie.
- Visualisatie van pathologische veranderingen onder een microscoop.
Belangrijkste resultaten
- Het gehele retinale vasculaire netwerk kan duidelijk worden gevisualiseerd.
- Pathologische veranderingen, zoals microaneurysma's en capillaire degeneratie, zijn waarneembaar.
- De methode biedt een significant voordeel ten opzichte van retinale flat mounts.
- De verbeterde helderheid maakt een betere analyse van vasculaire aandoeningen mogelijk.
Conclusies
- Trypsinevertering is een effectieve methode voor de analyse van de retinale vaten.
- Optimalisaties verbeteren de helderheid en het detail van de vasculaire visualisatie.
- Deze techniek kan helpen bij de studie van diverse retinale pathologieën.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Robuuste visualisatie van de retinale vasculatuur in genetisch gemodificeerde muismodellen is cruciaal voor targetvalidatie in een vroeg stadium en het mechanistisch verminderen van risico's bij de ontdekking van oftalmologische geneesmiddelen. Het trypsine-digestieprotocol maakt een hoogresolutie, kwantitatieve beoordeling van vasculaire pathologie mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid in ziekterelevante systemen. Deze mogelijkheid is essentieel voor portfoliotriage en het bevorderen van translationeel onderzoek naar retinale vasculaire aandoeningen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van vasculaire pathologie in genetisch gemodificeerde muismodellen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door kwantificering van microaneurysma's, capillaire degeneratie en celratio's.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door vasculair-specifieke fenotypes te isoleren van storend retinaal weefsel.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid voor downstream therapeutische hypothesetests.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerde workflow voor het prepareren van intacte vasculaire netwerken voor kwantitatieve analyse.
- Standaardiseert de monstervoorbereiding, wat de reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid van assays tussen studies verbetert.
- Maakt betrouwbare detectie van subtiele vasculaire veranderingen mogelijk voor compoundscreening in ziektemodellen.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van platforms in preklinische programma's voor vasculaire biologie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante eindpunten voor diabetische retinopathie en andere retinale vasculaire aandoeningen.
- Waarborgt continuïteit van genetische manipulatie tot fenotypische read-out in preklinische modellen.
- Vermindert het translationele risico door het leveren van kwantitatieve, pathologie-specifieke biomarkers.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van robuuste vasculaire fenotypering.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het protocol voor trypsinevertering is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot karakterisering van preklinische modellen, ter ondersteuning van zowel hypothese-gestuurde als fenotypische screeningworkflows.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van de nulhypothese door vasculaire effecten te isoleren van niet-vasculaire retinaalcomponenten.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor vergelijking tussen studies en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt de meting van endotheliale-pericyt-ratio's en de identificatie van vasculaire laesies mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Biedt ziekterelevante fenotypes voor de afstemming van biomarkers in modellen voor diabetische retinopathie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar protocol voor vasculaire analyse in genetisch gemodificeerde muizenlijnen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar de retinale vaten.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, standaardisatie en schaalbaarheid van workflows voor vasculaire fenotypering.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets en modellen mogelijk op basis van robuuste vasculaire eindpunten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist technische expertise in microdissectie en weefselverwerking voor consistente resultaten.
- Vereist toegang tot microscopie- en histologische kleuringsinfrastructuur voor eindpuntsanalyse.
- Noodzaakt strikte standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid over studies heen te waarborgen.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende soorten of retinagroottes, zoals opgemerkt voor ratten- versus muismodellen.
- Onvolledige verwijdering van niet-vasculair weefsel kan de datakwaliteit en visualisatie in gevaar brengen.
