Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking
6 december 2013
In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.
Het algemene doel van deze procedure is om enkele bacteriën en zich ontwikkelende isogene microkolonies te analyseren met volledige ruimtelijke en temporele resolutie onder constante omgevingscondities met behulp van een microfluïdisch kweekapparaat. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdisch kweeksysteem te ontwerpen met behulp van CAD-software. Vervolgens worden wegwerpbare microfluïdische kweekapparaten gemaakt van polydimethylsiloxaan die picoliter bioreactoren bevatten, een micron en hoogte om bacteriën te beperken tot monolaaggroei.
Microbiële cultuur wordt vervolgens in het microfluïdische apparaat geïnjecteerd om enkele moedercellen binnen de bioreactoren te inoculeren. Deze cellen worden uitgebreid door continue infusie van groeimedium door het systeem. Resultaten worden verkregen uit geautomatiseerde time-lapse microscopie die de kweek van een industrieel relevante stam van Corynebacterium glutamicum, groeidata en cel-cel heterogeniteit toont.
In conventionele biotechnologie zijn de meeste analyses gebaseerd op gemiddelde gegevens. Ons microfluïdische apparaat maakt eenpersoonsanalyse van individuele bacteriën met ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk. Het is een nuttig hulpmiddel om de cel-cel heterogeniteit van isogene microkolonies nader te bekijken.
We passen algemene SU-8 fotolitografie en polydimethylsiloxaan chipvorming toe om wegwerpbare microfluïdische apparaten met sub micro media resolutie te vervaardigen. We hebben onze technologie met succes gedemonstreerd met verschillende biotechnische micro-organismen zoals Escherichia coli en Corynebacterium glutamicum. Om te beginnen, ontwerpt u het microfluïdische apparaat met behulp van CAD-software.
Het ontwerp dat in dit protocol wordt gepresenteerd, bestaat uit twee zaaingangen, een gradiëntgenerator voor het mengen van twee verschillende substraten, een uitlaat en zes arrays die elk vijf bio-reactoren bevatten. Bereid in een cleanroom een vier-inch siliciumwafer voor en draai een laag van één micron SU-8 2000.5 fotoresist op de wafer zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats de gecoate wafer op een hotplate bij 95 graden Celsius om overtollig oplosmiddel te verwijderen en plaats vervolgens de eerste laag fotomasker bestaande uit de vasthoudgebieden van de picoliterreactoren en de gecoate wafer in de maskeraligner.
Stel vervolgens de wafer in vacuümcontactmodus bloot aan 350 tot 400 nanometer licht gedurende drie seconden met een intensiteit van zeven milliwatt per vierkante centimeter. Voer een post-exposure bake uit op een vlakke hotplate bij 95 graden Celsius om de polymerisatie van SU-8 te initiëren. Plaats vervolgens de wafer gedurende één minuut in een SU-8 developerbad en breng de wafer vervolgens over in een tweede container met verse SU-8 developer gedurende enkele seconden.
Spoel de wafer in isopropanol om de SU-8 developer te verwijderen en droog de wafer met behulp van stikstofstroom of een wafer spinner. Bak vervolgens de wafer gedurende 10 minuten bij 150 graden Celsius. Fabriqueer vervolgens de tweede laag zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol om de mastermal te voltooien.
Begin met de PDMS chipfabricage door de basis en het draagmiddel in een verhouding van 10 tot 1 te mengen. Ontgast het PDMS-mengsel gedurende ongeveer 30 minuten in een vacuüm exsiccator tot alle luchtbellen zijn verdwenen. Plaats vervolgens de SU-8 wafer in een mal en giet een drie millimeter laag PDMS-mengsel op de wafer.
Bak vervolgens de PDMS gedurende drie uur bij 80 graden Celsius in een oven. Zodra het is afgekoeld, verwijdert u voorzichtig de PDMS plaat van de wafer en snijdt u de plaat in enkele chips met behulp van een schone en scherpe scalpel. Was de chips in een n-pentaanbad gedurende 90 minuten, gevolgd door twee wasbeurten met aceton gedurende 90 minuten elk.
Laat de chips een nacht drogen om eventuele resten van oplosmiddel te verwijderen. Vlak voor het experiment, prikt u de inlaat- en uitlaatgaten in de PDMS chip met behulp van een naald of ponsmachine met een iets kleinere diameter dan de connectoren die worden gebruikt om slangen met PDMS chip te verbinden. Reinig vervolgens de microfluïdische PDMS chip zorgvuldig met isopropanol en gebruik scotch tape om eventuele vastzittende stofdeeltjes te verwijderen.
Reinig ook een 170 micron dunne glazen plaat eerst met aceton, vervolgens isopropanol, gevolgd door gedeïoniseerd water en droog de plaat met een stroom stikstof. Zodra het schoon en droog is, oxideert u de glazen plaat en PDMS chip gedurende 25 seconden met behulp van plasma met een vermogen van 50 Watt en een zuurstroomsnelheid van 20 sccm. Richt vervolgens de PDMS en glazen chip zorgvuldig uit voordat u de PDMS op het glas plaatst, wat ervoor zorgt dat deze binnen enkele seconden hecht.
Vastzet de binding door de opstelling gedurende 10 seconden bij 80 graden Celsius te bakken. Om de bacteriën voor een chipexperiment voor te bereiden, inoculeert u een enkele kolonie van een gewenste bacteriestam, zoals C. glutamicum in 20 milliliter vers BHI-medium en incubeer de cultuur een nacht bij 30 graden Celsius op een roterende shaker bij 120 RPM. De volgende ochtend draagt u 10 microliters van de startercultuur over in een tweede cultuur met 20 milliliter van het gewenste medium en laat u de cellen overnacht onder dezelfde omstandigheden groeien.
De volgende dag, verwarmt u de incubator van een omgekeerde microscoop voor tot 30 graden Celsius. Dit kan tot twee uur duren, afhankelijk van de individuele opstelling. Terwijl de opstelling warm wordt, opent u de incubator en selecteert u het gewenste objectief en bereidt u het voor met eventueel vereist montagemedium.
Monteer vervolgens de chip in de chiphouder en zet hem op zijn plaats. Centreer het monster op de microscoop en focus op de picoliter bioreactor arrays. Met de chip in focus, verbindt u de in- en uitlaten met geschikte slangen en plaatst u vervolgens de uitlaatslang in een afvalreservoir.
Vul vervolgens een spuit met vers medium, plaats deze in een spuitpomp en spoel de microfluïdische kanalen gedurende een uur bij een stromingssnelheid van 200 nanoliter per minuut om de chip te primen. Terwijl de cellen nog in de vroege exponentiële groeifase zijn, brengt u één milliliter
Overzicht
Dit protocol introduceert de fabricage en bediening van een microfluidische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cell analyse van prokaryotische micro-organismen. Het biedt inzicht in de groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit van industrieel relevante micro-organismen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microfluïdica
- Single-cell analyse
- Prokaryote microbiologie
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige controle van de omgevingscondities mogelijk.
- Conventionele methoden vertrouwen vaak op gemiddelde gegevens, wat het inzicht in het gedrag van individuele cellen beperkt.
- Single-cell analyse kan cel-tot-cel heterogeniteit onthullen.
- Microbiële kweektechnieken zijn essentieel voor het bestuderen van groeidynamiek.
Doel van de studie
- Om individuele bacteriën en isogene microkolonies te analyseren met ruimtelijke en temporele resolutie.
- Om een microfluïdisch kweekapparaat te ontwikkelen voor verbeterde microbiële analyse.
- Om de toepassing van het apparaat aan te tonen met verschillende micro-organismen.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van microfluïdische systemen met behulp van CAD-software.
- Het vervaardigen van apparaten van polydimethylsiloxaan (PDMS) met picoliter-bioreactoren.
- Geautomatiseerde time-lapse microscopie voor gegevensverzameling.
- Het inoculeren van individuele moedercellen en het continu toevoeren van groeimedium.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle cultivatie van Corynebacterium glutamicum en Escherichia coli.
- Inzichten in groeidata en cel-cel heterogeniteit.
- Demonstratie van de mogelijkheden van het microfluïdische apparaat voor analyse op enkelcelniveau.
- Effectief productieproces voor microfluïdische apparaten met sub-micrometer resolutie.
Conclusies
- De microfluïdische PLBR is een krachtig instrument voor het bestuderen van microbieel gedrag.
- Het maakt gedetailleerde analyse van individuele cellen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.
- Deze aanpak kan ons begrip van microbiële dynamiek aanzienlijk verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze microfluïdische picoliter-bioreactor maakt analyse op enkelcelniveau van microbiële stammen mogelijk onder strikt gecontroleerde omgevingscondities, waarmee een kritiek hiaat in fenotypische screening wordt opgevuld waarbij populatiegemiddelden de heterogeniteit van stammen maskeren. Door groeidynamiek, morfologie en stressresponsen op enkelcelniveau te ontrafelen, ondersteunt het platform doelwitvalidatie en de identificatie van lead-compounds in programma's voor antimicrobiële ontwikkeling en stamengineering. De compatibiliteit van het systeem met time-lapse fluorescentiemicroscopie maakt real-time monitoring van metaboliet- of eiwitproductie mogelijk, wat voorspellend vertrouwen geeft in de prestaties van de stam vóór opschaling.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door single-cell gedrag te koppelen aan genetische of omgevingsperturbaties in industrieel relevante microben.
- Operationele waarde: Ondersteunt de functionele targetvalidatie door directe observatie van stressrespons en metabolietproductie in gevangen single cells en microkolonies.
- Voorspellende waarde: Onthult cel-tot-cel heterogeniteit in groei en fluorescentie, wat het vertrouwen in de stamselectie voor verdere ontwikkeling vergroot.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op antimicrobiële of metabole screening door isogene microkolonies te isoleren die afkomstig zijn van enkele moedercellen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare read-outs van individuele cellen via geautomatiseerde time-lapse imaging, waardoor variabiliteit in groeisnelheid en fluorescentiemetingen wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: De eenvoudige PDMS-fabricage en het chipgebaseerde ontwerp maken een snelle aanpassing mogelijk voor verschillende microbiële soorten en assay-formaten in laboratoria met microfluidica-faciliteiten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen inzichten op single-cell niveau in de ontdekkingsfase en preklinische optimalisatie van stammen door tijdsvariabele fenotypes te volgen onder gecontroleerde mediastroming en perturbatiecondities.
- Mechanistische Risicoreductie: Maakt het mogelijk om oscillerende mediacondities te gebruiken om industriële fermentatiestressen na te bootsen, wat een vroege beoordeling van de robuustheid en productieconsistentie mogelijk maakt.
- Afstemming van Biomarkers: Faciliteert de correlatie van intracellulaire fluorescentie (bijv. vanuit induceerbare promotors) met groeidynamiek, wat biomarker-gestuurde stamontwikkeling ondersteunt.
Integratie van Pipeline en Workflow
De microfluïdische picoliter-bioreactor past binnen de workflow voor vroege ontdekking en maakt hypothese-gestuurde karakterisering van stammen mogelijk voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische optimalisatie.
- Discovery Biology: Test stam-specifieke reacties op substraten, induceerders of stressfactoren door de groei en fluorescentie van individuele cellen in real-time te monitoren.
- Screening: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste groeicurves en fluorescentietrajecten voor het vergelijken van clonale varianten onder identieke omstandigheden.
- Analytics: Levert data met single-cell resolutie over delingsnelheden, morfologische verschuivingen en eiwitexpressie, wat statistische deconvolutie van populatieheterogeniteit mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt microfluidische observaties met schaalbare fenotypes door single-cell gedrag te koppelen aan uitkomsten op populatieniveau in bioproductiecontexten.
- Enterprise Hergebruik: Het gestandaardiseerde chipontwerp en fabricatieproces maken hergebruik mogelijk in projecten gericht op verschillende microbiële chassis of productieroutes.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de prestaties van stammen door isogene heterogeniteit op te lossen die onzichtbaar is voor bulkassays zoals flowcytometrie of plaatlezers.
- Operationele waarde: Waarborgt milieubeheersing en precisie bij de uitwisseling van reagentia door middel van een continue mediastroom en snelle mediumwisseling, waardoor de betrouwbaarheid van de assay wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door subpopulaties met atypische productie of stressoverleving vroegtijdig in het ontdekkingsproces te identificeren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door stammen met instabiele of laag renderende subpopulaties te signaleren voordat er wordt geïnvesteerd in opschaling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microfluïdisch ontwerp, soft lithografie en het bedienen van tijdreeksmicroscopie.
- Is afhankelijk van toegang tot cleanroom-faciliteiten voor de fabricage van SU-8 masters en PDMS-gietapparatuur.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor chipsterilisatie, inoculatie en afsluiting om reproduceerbaarheid tussen gebruikers en laboratoria te garanderen.
- Aanpassing aan niet-modelorganismen kan optimalisatie van de vangafmetingen en mediastroomsnelheden vereisen op basis van celgrootte en groeikinetiek.
- Praktische beperkingen omvatten vervuiling van het device tijdens lange runs en de noodzaak voor handmatige chipmanipulatie ondanks geautomatiseerde beeldvorming.
