Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis
12 september 2013
De aangeboren immuunrespons beschermt organismen tegen pathogene infectie. Een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons, de fagocyt respiratory burst, genereert reactieve zuurstofradicalen die binnendringende micro-organismen te doden. We beschrijven een respiratoire burst test die reactieve zuurstofradicalen geproduceerd wanneer de aangeboren immuunrespons chemisch geïnduceerd kwantificeert.
Het algemene doel van deze procedure is om fluorescentie te gebruiken om de respiratoire burstrespons te kwantificeren. Laad eerst de zebravis-embryo's in de putjes van een 96-putjesplaat. Voeg vervolgens een fluorescerend substraat toe en activeer de respiratoire burst met een chemisch middel.
Meet vervolgens de relatieve fluorescentie met behulp van een fluorimeter. Uiteindelijk wordt de fluorescentie gebruikt om de respiratoire burstpotentie te tonen. Deze methode kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe experimentele manipulaties de algehele aangeboren immuungezondheid beïnvloeden.
Hier gebruiken we het om inzicht te geven in de respiratoire burst van zebravis-embryo's, maar het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals volwassen zebravissen, niercellen en celpreparaten van andere vissoorten. Laat de embryo's groeien in diepe petrischalen bij 28 graden Celsius in eierwater tot de gewenste ontwikkelingsfase. Verwijder dagelijks dode embryo's.
Giet voorzichtig het oude eierwater af en vul dagelijks aan met nieuw eierwater. Op de dag van het experiment, maak een verdunde fluoresceïne werkoplossing in een in folie verpakte 1,7 milliliter microcentrifugebuis. Bereid ook een werkoplossing van 20 microgram per milliliter PMA eindconcentratie voor.
Maak vervolgens vijf milliliter van elke doseringsoplossing in 15 milliliter conische buisjes zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Houd de doseringsoplossingen eerst op ijs, zet de Microplate-lezer aan en warm de lichtbron op om de fluorescentie te meten. Stel een programma in met details over de excitatie- en emissiegolvenlengten, de positie van de optica en gevoeligheid, en voeg ook een schudfase van vijf seconden toe.
Voor de uitvoering, schik de experimentele benodigdheden van schalen met gecoate embryo's. Een zwarte 96-putjes microplaat, een P 200 pipettor en tips, een ijsemmer met de fluoresceïne bevattende reagentia. Een multikanaals P 200 pipettor, twee steriele reservoirs, aluminiumfolie en schaar.
Snij nu een pipettip zodat de embryo's of nieren door de opening kunnen passen. Stel een P 200 pipettor in op 100 microliter en breng een embryo over samen met eierwater over in zoveel putjes van een zwarte 96-putjes microplaat als gewenst. Giet nu de doseringsoplossing in een steriele 25 milliliter reservoir met een multikanaals P 200 pipettor.
Voeg 100 microliter H 2D CFDA doseringsoplossing toe aan één kolom van de 96-putjes microplaat. Herhaal dit voor de helft van de controle-embryomonsters en de helft van de experimenteel gemanipuleerde embryomonsters. Giet de PMA-bevattende doseringsoplossing in een nieuw steriele 25 milliliter reservoir.
Breng vervolgens deze doseringsoplossing aan in de resterende kolommen van de 96-putjes microplaat. Bedek de Microplaat met aluminiumfolie en plaats deze gedurende ongeveer 20 seconden op een schudder. Bij 150 RPM, incubeer de Microplaat bij 28 graden Celsius wanneer deze niet wordt gelezen.
Lees de microplaat na toevoeging van PMA. Blijf gedurende de gewenste tijdsintervallen metingen doen, of incubeer de in folie verpakte microplaat bij 28 graden Celsius tot een vast tijdstip. Vervolgens haalt u de embryo's uit de putjes en euthanaseert u de embryo's volgens het protocol voor dierverzorging en -gebruik van de instelling.
Verwijder ook de microplaat en ander wegwerpbaar materiaal in de biogevaarlijke afvalbak. Bepaal het tijdstip waarop u de fluorescentie wilt vergelijken. Trek de gemiddelde fluorescentiewaarde van de niet-geïnduceerde controlegroep af van de individuele PMA-geïnduceerde controlegroep fluorescentiewaarden.
Herhaal dit voor de experimentele groep met en zonder PMA. Sla deze genormaliseerde fluorescentiewaarden op in kolommen, de controle plus PMA-groep en de experimentele plus PMA-groep. Bereken vervolgens de gemiddelden en standaardafwijkingen voor de genormaliseerde fluorescentiewaarden van de controle plus PMA-groep en de experimentele plus PMA-groep.
Vergelijk de genormaliseerde fluorescentiewaarden met behulp van een ongepaarde T-test om statistische significantie te bepalen. Teken vervolgens de gemiddelden van de controle plus PMA-groep en de experimentele plus PMA-groep met foutbalken weer die de juiste standaardafwijkingen weerspiegelen. Noteer het significantieniveau op de grafiek en in de figuurlegenda. Dit experiment vergelijkt de respiratoire burstrespons in wilde type zebravis-embryo's van AB-achtergrond op 48 uur en 72 uur na bevruchting.
De ruwe fluorescentie werd vier uur na toevoeging van PMA gemeten in de PMA-geïnduceerde groepen. De ruwe fluorescentiewaarden waren hoger in de 72 HPF populatie. Zoals aangegeven door de berekende gemiddelde waarden, zijn de fluorescentiewaarden genormaliseerd om rekening te houden met de variabiliteit in achtergrondniveaus van fluorescentie.
Resultaten van deze respiratoire bursttest onthulden dat de 72 HPF zebravis-embryo's in staat zijn om significant meer reactieve zuurstofsoorten te produceren en daarom een robuustere respiratoire burstrespons te vertonen dan 48 HPF embryo's na inductie met PMA. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescentie te gebruiken om de respiratoire burstpotentie van zebravis-embryo's te kwantificeren. Vergeet niet dat het werken met PMA-poeder extreem gevaarlijk kan zijn, dus gebruik voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van een mondmasker tijdens het wegen van PMA-poeder.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een assay voor de respiratoire burst waarmee reactieve zuurstofsoorten worden gekwantificeerd die worden geproduceerd tijdens de aangeboren immuunrespons. De methode maakt gebruik van fluorescentie om de respiratoire burst in zebravissenembryo's te meten wanneer deze worden geactiveerd door een chemisch agens.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Aangeboren immuniteit
- Fagocytenfunctie
- Reactieve zuurstofverbindingen
Achtergrond
- De aangeborenen immuunrespons is cruciaal voor de verdediging tegen pathogenen.
- Fagocyten genereren reactieve zuurstofcomponenten om micro-organismen te doden.
- Het kwantificeren van de respiratory burst kan inzicht geven in de immuungezondheid.
- Deze assay kan worden aangepast voor diverse experimentele manipulaties.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van de respiratory burst-respons.
- Om de effecten van chemische middelen op de aangeborene immuunfunctie te beoordelen.
- Om een instrument te bieden voor het bestuderen van de immuungezondheid in zebravismodellen.
Gebruikte methoden
- Het laden van zebravisembryo's in een 96-wells plaat.
- Het toevoegen van een fluorescent substraat aan de wells.
- Het activeren van de respiratoire burst met een chemisch agens.
- Het kwantificeren van fluorescentie met behulp van een fluorimeter.
Belangrijkste resultaten
- De assay kwantificeert met succes het potentieel voor de respiratoire burst.
- Fluorescentieniveaus correleren met de aangeboren immuunrespons.
- Deze methode maakt het mogelijk om de immuungezondheid te beoordelen.
- Experimentele manipulaties kunnen met deze assay worden geëvalueerd.
Conclusies
- De respiratory burst-assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van de aangeboren immuniteit.
- Fluorescentiekwantificering biedt inzicht in immuunresponsen.
- Deze methode kan het begrip van de immuungezondheid in onderzoek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het kwantificeren van de respons op de respiratoire burst biedt een functionele aflezing van de aangeboren immuungezondheid in zebravismodellen, wat vroege evaluatie van immunomodulerende verbindingen mogelijk maakt. Deze assay ondersteunt doelwitvalidatie door genetische of farmacologische manipulaties te koppelen aan meetbare veranderingen in de productie van reactieve zuurstofspecies, een belangrijk effectormechanisme in de afweer tegen pathogenen. De aanpasbaarheid van de methode over verschillende ontwikkelingsstadia en monstertypes verhoogt de bruikbaarheid bij het verminderen van risico's voor immunomodulerende lead-verbindingen vóór preklinische investeringen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de functionele output van fagocytenactivatie te meten in reactie op experimentele manipulaties.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicovermindering mogelijk door een kwantitatieve vergelijking van het potentieel voor de respiratory burst over verschillende genetische condities of behandelingen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van de portfolio door assay-resultaten te correleren met de aangeboren immuuncompetentie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen over immunomodulerende kandidaten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde, kwantitatieve fluorescentie-outputs die geschikt zijn voor high-throughput screening van verbindingenbibliotheken.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van genormaliseerde fluorescentie en statistische vergelijking (ongepaarde t-toets) om betrouwbare vergelijkingen tussen experimenten te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met 96-well plaatformaten, wat testen onder meerdere condities en cross-platform hergebruik in workflows voor immuunprofilering vergemakkelijkt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert de aangeborene immuunrespons die relevant is voor infectie en ontsteking, ter ondersteuning van de afstemming van translationele biomarkers.
- Preklinische Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en functionele immuunvalidatie in volledige organismen of weefselpreparaten.
- Risico-geoptimaliseerde Vooruitgang: Informeert beslissingen over lead-optimalisatie door verbindingen te identificeren die de respiratoire burst-activiteit significant moduleren.
Integratie van Pipeline en Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en levert functionele immuunprofielgegevens die complementair zijn aan targetengagement en fenotypische screenings.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen door gene knockdown, overexpressie of medicamenteuze behandeling te koppelen aan meetbare veranderingen in de effectorfunctie van de aangeboren immuniteit.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die een betrouwbare vergelijking mogelijk maken van de effecten van verbindingen op de activatie van fagocyten.
- Analytics: Genereert genormaliseerde fluorescentiewaarden en statistische resultaten (gemiddelden, standaarddeviaties, t-toetsresultaten) die een objectieve vergelijking van experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege bevindingen over immuniteit met preklinische relevantie door gebruik in nieren van volwassen zebravis en cellen van verschillende soorten.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Functioneert als een modulaire readout voor immuungezondheid die toepasbaar is in meerdere projecten die immunomodulatie, infectiemodellen of inflammatoire pathways bestuderen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit rond immunomodulerende effecten te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde protocollen voor substraatincubatie, inductie en meting.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van immunomodulerende leads mogelijk te maken op basis van functionele read-outs van de immuungezondheid.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen te identificeren die het potentieel voor respiratory burst significant veranderen, wat dient als proxy voor de aangeboren immuuncompetentie.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de hantering van zebravisembryo's, fluorescentiemeting en statistische analyse van genormaliseerde gegevens.
- Afhankelijk van toegang tot een microplaatlezer met fluorescentiedetectiecapaciteit en een juiste opwarmtijd van de lichtbron.
- Vereist cross-team standaardisatie van het embryonale stadium, de timing van de dosering en protocollen voor achtergrondaftrek.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op volwassen weefsels of andere vissoorten, zoals vermeld in de bron.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de gevaarlijke aard van PMA, waardoor veiligheidsmaatregelen bij het hanteren en wegen noodzakelijk zijn.
