Isolatie van microvasculaire endotheelcellen Buizen van Mouse Resistance Arteries

Het algemene doel van deze procedure is om endotheelcelbuizen te isoleren van de superieure epigastrische slagader of SEA van de muis om de intra- en intercellulaire signaaldinamiek van een natuurlijk intact microvasculair endotheel te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de SEA van de muisachtige buikwand te isoleren. In de tweede stap wordt het vat voorzichtig en somatisch gedigesteerd en vervolgens zorgvuldig geïncubeerd om de gladde spiercellen en adventitia van de endotheelcelbuis te dissociëren.

In de laatste stap wordt de buis bevestigd in een stroomkamer en super gefusioneerd met een fysiologische zoutoplossing. Uiteindelijk kan confocale beeldvorming worden gebruikt om calciumsignalering in de natuurlijke intacte microvasculaire endotheelbuis te visualiseren. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals het kweken van endotheelcellen, is dat de endotheelcellen die de buis vormen en hun natuurlijke morfologie, eiwitexpressie en responsiviteit behouden. Het endotheel is essentieel voor de controle van de bloedstroom in het hele lichaam.

De toepassing van deze techniek stelt ons in staat om de cel-tot-cel signaleringsgebeurtenissen die de bloedstroom regelen te onderzoeken en hoe deze kunnen misgaan tijdens vasculaire disfunctie. Om de SEA eerst te isoleren, maak een kleine incisie door de huid net boven het gebied van de schaamstreek van een verdoofde muis, verleng de incisie lateraal in elke richting tot de respectieve achterpoten en vervolg de incisie dan rollangs de ventrale middenlijn tot de bovenkant van de ribbenkast, en verleng de incisie verder lateraal in elke richting tot de respectieve vier ledematen. Til nu voorzichtig de huid op en snijd het bindweefsel dat de huid aan de onderliggende spier vasthoudt, waardoor het hele oppervlak van de buikspieren wordt blootgesteld.

Irrigeer de blootgestelde spier met fysiologische zoutoplossing op kamertemperatuur. Til vervolgens onder een stereomicroscoop het vetkussen op dat zich aan de onderkant van het borstbeen bevindt. Maak een incisie door het vetkussen en langs de onderste rib.

De SEA moet nu zichtbaar zijn, zorg ervoor dat u de slagader niet beschadigt, irrigeer het blootgestelde weefsel met meer fysiologische zoutoplossing op kamertemperatuur. Nadat de bovenste laag skeletspier is teruggetrokken, noteer de lengte van de SEA en snij vervolgens voorzichtig de dunne spierlaag onder de slagader door. Gebruik vervolgens hoekige pincetten om een lengte van zes oh zijden draad onder de SCA te passeren.

Bind vervolgens de slagader en de aangrenzende ader om het onder druk te houden en om het bloed binnen het vaatlumen te houden. Nadat de SCA aan de contralaterale zijde is gebonden, maak een incisie langs de middenlijn van de buikspieren om de respectieve zijden te scheiden en verleng de incisie lateraal in elke richting zoals voor de huid is gedaan. Vervolg de incisie verticaal langs de buitenrand om de buikspier volledig van het lichaam te scheiden.

Snijd vervolgens de SEA boven de ligatuur om het afdichtingsmiddel te behouden en plaats de geïsoleerde spier en slagader in een beker van 50 milliliter met 10 milliliter vier graden Celsius dissectiebuffer. Nadat de spier van de andere kant van de buik is geïsoleerd, incubeer de weefsels gedurende 10 minuten in dissectiebuffer. Plaats nu de buikspier met de SEA in een Petri-schaal van vier graden Celsius die is gecoat met een laag cyl guard en die dissectiebuffer bevat. Gebruik 0,15 millimeter insectenpinnen om de SEA en de spier te strekken tot hun eerder opgemerkte geschatte in vivo-lengte.

Beveilig de SEA aan de cyl guard en oriënteer de spier zodanig dat de dunne laag die naar het peritoneum is gericht bovenaan is. Werk vervolgens vanaf de stroomopwaartse plaats van ligatuur naar het stroomafwaartse uiteinde ongeveer één tot twee centimeter van de SEA van zijn gepaarde ader en het omliggende weefsel tot de eerste belangrijke vertakkingsplaats. Snijd de SEA net boven de vertakkingsplaats en net onder de ligatuur.

Gebruik vervolgens een stuk elastisch buiswerk om de achterkant van een pipette aan een vijf milliliter spuit met ijskoud dissectiebuffer te bevestigen. Bevestig de canuleringspipettip in de dissectiekamer en canuleer de SEA. Nadat alle erytrocyten zijn weggespoeld, verwijder de SEA van de canuleringspipet en verwijder de pipette uit de dissectieschaal om de endotheelbuizen te isoleren.

Vul eerst een 12 bij 75 millimeter glazen kweekbuis voor de helft met ijskoud dissectiebuffer. Nadat de SEA in stukken van één tot drie millimeter is gesneden, gebruikt u hoekige pincetten om de arteriële stukken over te brengen naar de kweekbuis en plaats de buis op ijs. Combineer vervolgens verteringsenzymen met de dissociatiebuffer tot een eindvolume van één milliliter in een aparte 12 bij 75 millimeter kweekbuis en verwarm de enzymoplossing tot 37 graden Celsius met een verwarmingsblok.

Verwijder de kweekbuis met de arteriële stukken van vier graden Celsius en plaats deze op kamertemperatuur om op te warmen terwijl de enzymoplossing opwarmt tot 37 graden Celsius. Aspibeer voorzichtig de nu op kamertemperatuur zijnde dissectiebuffer uit de kweekbuis, waardoor een klein volume met de vaatsegmenten overblijft. Voeg nu langzaam dissociatiebuffer op kamertemperatuur zonder enzymen toe aan de vaatsegmenten zodat de arteriële stukken op de bodem van de kweekbuis blijven om eventueel resterend dissectiebuffer weg te wassen.

Zodra de enzymoplossing 37 graden Celsius heeft bereikt, aspibeer de dissociatiebuffer uit de kweekbuis met de vaatsegmenten opnieuw, waardoor een klein volume met de vaatsegmenten overblijft. Breng nu de 37 graden enzymoplossing over naar de kweekbuis en incubeer de kweekbuis gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in de verwarmingsblok. Tijdens de incubatie bereidt u een literatiepippetje voor dat gevuld is met minerale olie, scoreert u de pipette, maakt u een schone breuk, breekt u de pipette met behulp van een pincet, polijst u de punt van de pipette en bevestigt u deze op een microspuiten die in een micro