Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

Het algemene doel van deze procedure is om antigeenretrieval uit te voeren op hersenweefsel van de hippocampus om de voorlopercelverscheidenheden die aanleiding geven tot nieuwe neuronen beter te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst het geperfuseerde hersenweefsel van een muis te oogsten, dunne coronale secties te snijden en deze secties op een glasplaat te monteren, speciaal ontworpen om sterk aan het weefsel te hechten. De tweede stap is om de slides met weefsel en Kay atopic behandeling te koken en voldoende tijd te geven voor afkoeling.

Vervolgens wordt het weefsel een nacht lang gekleurd met primaire antilichamen. De laatste stap is om de volgende dag secundaire antilichaamkleuring op het weefsel uit te voeren gedurende minimaal twee uur. Uiteindelijk visualiseert u de verschillende voorlopercelverscheidenheden in de verschillende ontwikkelingsstadia tijdens de neurogenese van de hippocampusweefsel met time lapse of confocale microscopie.

Hallo, mijn naam is Hun Jo, een postdoc, lid van Dr.Ian Johns lab en Mayo Clinic. Ons hoofddoel in John Lab is het onderzoeken van het proces van neurogenese bij neurologische en psychiatrische aandoeningen. Ons einddoel is om dergelijke kennis succesvol te vertalen in therapeutische toepassingen. Onze procedure voor antigeenretrieval zal Quam Hui zijn, en hallo John van ons laboratorium.

Het belangrijkste voordeel van onze techniek boven bestaande methoden van immunohistologie is dat het een effectieve visualisatie van verschillende celtypen mogelijk maakt tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen. Deze celtypen, inclusief de voorlopercellen van neurale stamcellen die anders moeilijk te detecteren zijn, kunnen efficiënt worden gelabeld en gevisualiseerd met onze methode van antigeenretrieval. Deze methode zal inzicht geven in de ontwikkeling en regulatie van nieuwe neuronen tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen.

Voor degenen die geïnteresseerd zijn in de studie van psychische stoornissen en farmacologische behandeling, zal onze antigeenretrieval nuttig zijn bij het onderzoeken van de rol van neuronale ontwikkeling tijdens deze ziekte.Pathogenese. Begin de procedure door de hersenen van een geperfuseerde muis in 4% para formaldehyde in een 10 milliliter conische buis gedurende een nacht bij vier graden Celsius, of minimaal 12 tot 24 uur, maar niet meer dan 36 uur voor volledige fixatie te plaatsen. Na overnacht fixatie, verwijder PFA en laat de hersenen in de conische buis.

Spoel vervolgens de hersenen met 30% sucrose om eventueel resterend PFA te verwijderen en gooi de sucrose weg. Vul vervolgens de buis opnieuw met 30% sucrose en bewaar het bij vier graden Celsius totdat de hersenen naar de bodem van de buis zinken. Snijd daarna de hippocampus in 40 micrometer hersensecties op een microtoom.

Bewaar de secties in de antivriesoplossing totdat ze klaar zijn voor immunohistologie. Monteer vervolgens de plakken op de microscoopglazen die speciaal ontworpen zijn om sterk aan het weefsel te hechten. Laat de slides na montage van het weefsel ongeveer 10 minuten drogen.

Het drogen kan worden versneld als de slides tegen een verticale oppervlakte op een papieren handdoek worden gelegd om volledige verwijdering van eerdere chemicaliën te garanderen. Zodra de slides droog zijn, spoel ze drie keer gedurende vijf minuten met PBS. Laat ze vervolgens weer drogen.

Bereidt in deze procedure de oplossing voor weefselkoken volgens de beschrijving in het bijbehorende manuscript. Kook vervolgens de oplossing gedurende vijf minuten in een standaard magnetron op standaardinstelling. Zodra het koken voltooid is, verwijdert u voorzichtig de container uit de magnetron.

Transfer vervolgens de gedroogde slides in de oplossing. Zorg ervoor dat de kant met de hippocampale secties volledig blootgesteld is aan de oplossing. Plaats indien mogelijk de slides onder een hoek tegen de wanden van de container en stapel andere slides eromheen.

Kook vervolgens het mengsel met de slides gedurende zeven minuten in de magnetron op standaardinstellingen. Vul ondertussen twee ijsemmers voor de helft met ijs. Zodra het koken voltooid is, verwijdert u de container uit de magnetron en plaatst u deze in een van de ijsemmers.

Plaats het overgebleven ijs uit de andere emmer rond de container en bedek deze volledig. Laat het daarna een uur zitten na een uur. Verwijder de slides uit de container.

Spoel ze drie keer gedurende vijf minuten met TBST-buffer. Bereid ondertussen een kamer met DDH twee O voor voor overnacht primaire antilichaamkleuring.

Zodra de slides droog zijn, tekent u een omtrek rond de weefselsecties met een waterafstotend potlood. Deze omtrek dient als een barrière om te voorkomen dat het antilichaammengsel eroverheen stroomt. Bereid vervolgens het primaire antilichaammengsel in T-B-S-T-T voor.

Plaats de gedroogde slides op het podium in de kleuringskamer. Voeg langzaam 500 microliters van het primaire antilichaam toe om het hele oppervlak te bedekken. Dek vervolgens de kleuringskamer af om externe lichtbronnen te blokkeren en bewaar het overnacht op kamertemperatuur. De volgende dag spoel de slides drie keer gedurende vijf minuten met TBST-buffer.

Droog ze vervolgens in het donker. Bereid nu het secundaire antilichaammengsel in T-B-S-T-T voor. Plaats vervolgens de droge slides in de kleuringskamer.

Voeg 500 microliters van het secundaire antilichaam toe. Bedek langzaam de kleuringskamer en bescherm deze gedurende minimaal twee uur op kamertemperatuur tegen externe lichtbronnen. Na voltooiing van de secundaire kleuring spoelt u de slides drie keer gedurende vijf minuten met TBST-buffer, droogt u de slides in het donker na het drogen. Voeg montageoplossing toe aan de slides.

Dek ze voorzichtig af met dekglasjes om de introductie van eventuele luchtbellen te voorkomen. Bewaar de slides vervolgens gedurende minimaal twee uur in het donker voor verdere analyse en het uitvoeren van time lapse of convo-analyse op het gekleurde weefsel. Volwassen neurogenese van de hippocampus wordt weergegeven in de subgranulaire zone van de dentate gyrus.

Een geactiveerde radiale